Научно-методические основы комплексной технологии получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов - продуцентов эпидермального фактора роста

Научно-методические основы комплексной технологии получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов - продуцентов эпидермального фактора роста

Автор: Никитина, Зоя Кимовна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2000

Место защиты: Москва

Количество страниц: 299 с. ил.

Артикул: 302239

Автор: Никитина, Зоя Кимовна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ v
1. Пептидные факторы роста
1.1. Основные свойства.
1.2. Механизм действия. Рецептор, рецепторопосредованный эндоцитоз.
1.3. Физиологическая роль ростовых факторов в организме
2. Эпидермальный фактор роста
2.1. Биологическая роль в организме в норме
2.2. Физиологическая роль ЭФР при различных патологиях.
3. Технологические особенности выделения. очистки и стандартизации ЭФР.
3.1. Физикохимические и иммунологические свойства ЭФР.
3.2. Источники получения ростового фактора.
3.3. Методы выделения, очистки и стандартизации ЭФР
4. Особенности экспрессии гетерологичных протеинов в vii.
4.1. Технология синтеза гетерологичных протеинов дрожжевыми клетками
4.2. Влияние экзогенных факторов регуляции
4.3. Способы стабилизации плазмид в клетках .vii.
5. Основы комплексной переработки дрожжевых клеток vii.
5.1. Иммуномодулирующие полисахариды дрожжей.
5.2. Рибонуклеиновые кислоты дрожжевых клеток и возможности их использования в медицине.
6. Иммунохимические тестсистемы и предпосылки создания
диагностикумов на ЭФР
6.1. Общие сведения о диагностикумах.
6.2. Эритроцитарные и латексные диагностикумы
7. Некоторые особенности получения глазных лекарственных
Глава 2. Материалы и методы исследования.
1. Характеристика используемых микроорганизмов продуцентов ЭФР
1.1. Культивирование рекомбинкнтных штаммов
1.2. Хранение рекомбинантных штаммов.
1.2.1. Криоконсервирование.
1.2.2. Хранение под растворами глицерина и вазелиновым маслом.
1.2.3. Определение соотношения плазмидсодержащих и бесплазмидных клеток.
2. Методы выделения и очистки ЭФР
2.1. Получение ЭФРобогащенной фракции из подчелюстных слюнных желез мышейсамцов
2.2. Получение ЭФРобогащенной фракции из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов.
2.3. Методы хроматографической очистки.
2.3.1. Хроматография на биогеле Р
2.3.2. Ионнообменная хроматография.
2.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.4. Выделение ЭФР из культуральной жидкости методами
иммуносорбции
2.4.1. Иммунизация животных
2.4.2. Определение титра антител против ЭФР в иммунной сыворотке
2.4.3. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки иммунизированных животных
2.4.4. Получение иммуносорбентов и выделение ЭФР из культуральной жидкости методами иммуносорбции
3. Методы стандартизации ЭФР
3.1. Дискэлектрофорез в ПААГ.
3.2.ВЭЖХ аналитический вариант
3.3. Аминокислотный анализ
3.4. Определение биологической активности ЭФР.
3.4.1. В условиях i viv.
3.4.2. В условиях i vi
3.4.2.а. Определение метаболической активности фибробластов человека в культуре клеток с использованием меченных предшественников.
3.4.2.6. Определение метаболической активности клеток
различных слоев эпидермиса.
4. Конструирование эритроцитарных диагностикумов на ЭФР
4.1. Консервация эритроцитов барана.
4.2. Сенсибилизация эритроцитов барана
4.2.1. Активация формалинизированных эритроцитов барана
4.2.2. Таннизация эритроцитов барана
4.2.3. Иммобилизация ЭФР на поверхности таннизированных эритроцитов барана
4.3. Методы контроля на различных этапах конструирования
ЭД на ЭФР.
4.3.1. Контроль неспецифической агглютинации
4.3.2. Оценка стабильности сенсибилизированных эритроцитов барана при хранении.
4.3.3. Стандартизация готового диагностикума по реакции
пассивной гемагглютинации.
4.4. Оценка чувствительности антагенного эритроцитарного
диагностикума
4.4.1. Выбор рабочего титра антисыворотки
4.4.2. Постановка реакции торможения пассивной гемагглютинации с использованием стандартного раствора антигена.
5. Методы разработки состава и технологии получения ранозаживляющих средств с использованием ЭФР на примере глазных капель.
5.1. Определение пролонгирующей активности вспомогательных веществ
5.2. Стерилизация растворов ЭФР
5.3. Определение терапевтической активности и острой токсичности
5.3.1. Хирургическая деэпителизация роговицы глаза.
5.3.2. Получение гистологических срезов роговицы глаза.
5.3.3. Определение острой токсичности
5.4. Изучение стабильности глазных капель
5.4.1. Изучение стабильности лиофильновысушенного ЭФР
при хранении.
5.4.2. Изучение стабильности ЭФР в составе глазных капель
6. Методы выделения и стандартизации иммуномодулирующих полисахаридов из дрожжевых клеток.
6.1. Получение иммуномодулирующих полисахаридов из дрожжевых клеток.
6.2. Стандартизация иммуномодулирующих полисахаридов.
6.2.1. Определение физикохимических свойств полисахаридов.
6.2.1.а. Контроль препаратов с помощью световой микроскопии
6.2.1.6. Качественная реакция на мукополисахариды .
6.2.1.в. Испытание суспендирующей способности препаратов
6.2.1.г. Качественный и количественный анализ структурных компонентов препаратов
6.2.2. Определение биологической активности препаратов
6.2.2.а. Определение количества лейкоцитов в периферической крови.
6.2.2.6. Определение розеткообразующей способности лейкоцитов
6.2.2.в. Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов
6.2.2.г. Определение серологической активности
7. Методы выделения и стандартизации нуклеиновых кислот из рекомбинантных штаммов продуцентов ЭФР
7.1. Выделение РНК методом аффинной хроматографии.
7.2. Стандартизация препаратов РНК
7.2.1. Электрофорез в ПААГ
7.2.2. Определение нуклеотидного состава
8. Разные методы, используемые в работе.
8.1. Количественное определение биологически активных веществ белка, нуклеиновых кислот, сахаров и т.д
8.2. ИКспектроскопия.
8.3. Определение радиоактивности клеток.
8.4. Статистическая обработка результатов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Изучение свойств микроорганизмовпродуцентов ЭФР
3.1. Исследование продуктивности рекомбинантных штаммов vii.
3.2. Разработка метода определения плазмидсодержащих и бесплазмидных клеток в процессе культивирования и
хранения
3.3. Использование различных питательных сред для культивирования рекомбинантных штаммов с целью увеличения их продуктивности.
3.4. Оптимизация условий консервации штаммов, обеспечивающих
сохранение их жизнеспособности и продуктивности
Глава 4. Разработка методов выделения, очистки и
стандартизации ЭФР
4.1. Выделение и свойства ЭФР из слюнных желез мышейсамцов.
4.2. Разработка метода выделения ростового фактора из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов .vii с помощью традиционных хроматографических процедур.
4.3. Разработка метода выделения ЭФР из культуральной жидкости .vii с помощью иммуносорбции
4.4. Разработка биотест системы для определения активности ЭФР с использованием клеток эпидермиса.
Глава 5. Примеры использования ЭФР для получения
диагностикумов и ранозаживляющих лекарственных средств.
5.1. Разработка диагностических тестсистем для определения ростового фактора в биологических жидкостях
5.2. Разработка технологии получения и состава ранозаживляющих средств на основе ЭФР на примере глазных капель
Глава 6. Повышение технологической эффективности получения
ЭФР путем снижения отходов
6.1. Выделение и стандартизация иммуномодулирующих полисахаридных препаратов из отработанной биомассы рекомбинантных штаммов .vii
6.2. Использование отходов получения ростового фактора и иммуномодулирующих полисахаридных препаратов в качестве компонентов питательных сред.
6.3. Выделение и свойства препаратов РНК из технологических отходов при получении ЭФР.
Глава 7. Заключение и общая технологическая схема получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов продуцентов ЭФР.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АА акриламид
АЭД антигенный эритроцитарный диагностикум БА белковый антиген
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ВМ вторичные мессенджеры
ЖКТ желудочнокишечный тракт
ИГ иммуноглобулины
ИЛ интерлейкины
ИНФ интерфероны
ИОХ ионнообменная хроматография
ИРФ инсулиноподобные ростовые факторы
ИРЭФР иммунореактивный эпидермальный фактор роста
КСФ колониестимулирующие факторы
ЛД латексные диагностикумы
МБА М,Ыметиленбисакриламид
мЭФР эпидермальный фактор роста мыши
НБС небелковый антиген
ОПН острая почечная недостаточность
офВЭЖХ обратнофазная ВЭЖХ
ПКА портоковальный анастамоз
ПФР полипептидные факторы роста
ПЯЛ полиморфноядерные лейкоциты
РОК розеткообразующие клетки
РПГА реакция пассивной гемагглютинации
РТПГА реакция торможения пассивной гемагглютинации
СМФ система мононуклеарных фагоцитов
ТЕМЕД М,МХМтетраэтилендиамин
ТФР трансформирующие факторы роста
ТХУ трихлоруксусная кислота ФИ фагоцитарный индекс ФНО фактор некроза опухолей ФР факторы роста
ФРВТ фактор роста, выделяемый тромбоцитами ФРФ фактор роста фибробластов ФЧ фагоцитарное число ЦНС центральная нервная система ЧСА сывороточный альбумин человека чЭФР эпидермальный фактор роста человека ЭБ эритроциты барана ЭД эритроцитарный диагностикум ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЭФР эпидермальный фактор роста ЭФРР рецептор эпидермального фактора роста додецилсульфат натрия быстрая жидкостная хроматография поверхностный антиген гепетита В забуференный физиологический раствор среда, содержащая дрожжевой экстракт, гидролизат сои и декстрозу
среда, содержащая дрожжевой экстракт и пептоны среда, содержащая дрожжевой экстракт, пептоны и декстрозу
дрожжевая минеральная среда, содержащая азот
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


Они синтезируются при повреждении тканей, инфекциях и различных иммунных ответах. Так, ИЛ6 игает роль основного медиатора синтеза специфических белков в острой фазе воспаления . Иммуномодуляторные эффекты показаны и для других ростовых факторов ФИО принимает участие в воспалительных и шоковых реакциях, рТФР проявляет выраженные иммуносупрессорные свойства 6. Считается общепринятым трофический ростостимулирующий эффект цитокинов иммунокомпетентных клеток матери на фетоплацентарные ткани. ИЛ1 стимулирует рост клеток плаценты и тем самым принимает активное участие в процессах репродукции у млекопитающих 6. ФНО, рТФР и другие цитокины необходимы для развития нормальной беременности, поскольку они лимитируют процессы синтеза ДНК клетками трофобласта 8, 0 и плаценты 6, что, повидимому, ограждает организм беременной женщины от злокачественной инвазии клетками плода. Показано, что ИЛ1 принимает участие в регенерации печени и других процессах репарации тканей 6. Отмечены выраженные репаративные эффекты 3ТФР 4. ИНФ активирует процессы регенерации при механическом разрушении тканей за счет усиления миграции фибробластов в зону поражения и повышения их функциональной активности, ускорения процессов реэпителизации и синтеза коллагена 9. Есть все основания считать, что ростовые факторы играют важную роль в процессах нормального развития организма. Физиологической функцией ФИО является модуляция роста клеток 8, ИЛ1 вызывает пролиферацию клеток эндотелиальных сосудов в процессе их роста 2. ИЛ3 стимулирует деление полипотентных кроветворных клеток предшественниц всех ростков кроветворения за счет ускорения транспорта глюкозы через клеточную мембрану и перераспределения протеинкиназы С . ТФРа участвует в регуляции пренатального роста организма , являясь, повидимому, эмбриональной формой ЭФР 6. Во многих случаях показано, что ростовые факторы могут тормозить рост и развитие опухолевых клеток. Этот эффект показан для интерлейкинов . ИЛ1 оказывает цитотоксическое действие на миеломные клетки, проявляя противоопухолевую активность 4. При этом показано, что противоопухолевой эффект дозозависим и наиболее выражен при внутримышечном и внутривенном введении 0. ИЛ4 увеличивает противоопухолевую активность макрофагов 0. ИНФ также блокирует опухолевой рост и метастазирование 9. Исходя из приведенных данных о биологических эффектах ростовых факторов в организме становится очевидным перспективность их использования в медицине в качестве лекарственных средств. Большинство интерлейкинов нашло применение в клинической практике при лечении ряда заболеваний . Например, ИЛ1 может быть включен в схемы комплексной терапии при иммунодефицитных состояниях различной этиологии. Известные антивирусные эффекты интерферонов позволяют использовать их в качестве препаратов для лечения заболеваний вирусной и неопластической природы . В связи с цитотоксическим действием некоторых ростовых факторов на опухолевые клетки предпринимаются попытки использования их в качестве средств, проявляющих противоопухолевую активность , 0. Способность ИЛ4 стимулировать генерацию киллерных клеток дает возможность использовать этот цитокин в комбинации с ИЛ2 в иммунотерапии рака . Анализируя эффекты ИНФ на клетки неиммунной природы, ряд исследователей приходят к выводу, что эти цитокины усиливают процессы ангиогенеза, способствуют заживлению ран, блокируют опухолевой рост и метастазирование 8. Предполагается, что применение ФИО совместно с другими ростовыми факторами позволит получать нормальные клетки из гомологичных им злокачественных нормализация опухолевых клеток, так как показано участие ФИО в сохранении дремлющего состояния опухоли 3. Повидимому, в ближайшем будущем в качестве фармакологических агентов или мишеней в терапии злокачественных новообразований могут быть использованы ЭФР, ФРВТ, ТФР и другие 8. В то же время следует отметить, что ростовые факторы в организме и i vi могут играть противоположные роли, так, попытки лечения рака путем введения ингибиторов роста кейлонов в большинстве случаев оказались безуспешными .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.194, запросов: 145