Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения

Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения

Автор: Мосин, Олег Викторович

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 1996

Место защиты: Москва

Количество страниц: 109 с. ил.

Артикул: 155742

Автор: Мосин, Олег Викторович

Стоимость: 250 руб.

Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения  Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения 

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2Н0, ,3С, ,5К обзор литературы.
1.1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2Н0, 3С, Ы.
1.1.1. Использование БАС в биохимических исследованиях
1.1.2. Использование меченных БАС в химических синтезах и в диагностике
1.1.3. Использование меченных БАС в структурно функциональных исследованиях
1.2. Методы получения изотопномеченных БАС
1.2.1. Химические синтезы изотопномеченных БАС
1.2.2. Изотопный обмен НО в молекулах БАС
1.2.3. Биотехнологический метод получения изотопномеченных БАС
1.2.4. Использование микроводорослей для получения изотопномеченных БАС
1.2.5. Использование гетеротрофных бактерий для получения изотопномеченных БАС
1.2.6. Использование метилотрофных бактерий для получения изотопномеченных БАС
1.2.7. Ссриновый путь ассимиляции Ссоединений
1.2.8. Рибулзо5монофосфатный путь ассимиляции Ссоединений
1.2.9. Получение изотопномеченных БАС за счт биоконвсрсии 3СНзОН или
СЭзСЮ в мстилотрофах
1.2.9.1. Получение дейтериймеченных БАС
1.2.9.2. Методы получения 3СБАС
1.2.9.3. Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопномеченных БАС
1.2.9.4. Генноинженерные методы получения изотопномеченных БАС
1.3. Выделение изотопномеченных БАС из гидролизатов бактериальной биомассы.
1.3.1. Ионнообменная хроматография изотопномеченных БАС
1.3.2. Выделение изотопномеченных БАС методами обращннофазовой ВЭЖХ
1.4. Химикоферментативный метод получения изотопномеченных БАС.
1.4.1. Использование ферментативных систем для получения стабильномеченных аминокислот
1.4.2. Получение дейтериймеченных аминокислот за счт изотопного обмена НО в ферментативных системах
1.4.3. Использование ааминокислот в качестве интермедиантов при получении дейтериймеченных аминокислот
1.4.4. Получение дейтериймеченных аминокислот из их низкомолекулярных предшественников
1.4.5. Получение изотопномеченных ароматических аминокислот
1.4.6. Получение аминокислот
1.5. Исследование биосинтеза БАС в гетеротрофных бактериях.
1.5.1. Исследование биосинтеза аминокислот, сахаров, липидов и нуклеозидов
1.5.2. Биосинтез аминокислот
1.5.3. Биосинтез сахаров
1.5.4. Биосинтез липидов
1.5.5. Биосинтез нуклеозидов
1.6. Методы исследования БАС, меченных стабильными изотопами 2Н0, С,
1.6.1. Исследование структуры БАС методами ЯМР
1.6.2. Спектроскопия ЯМР тврдого тела
1.6.3. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции рентгеновских лучей
1.6.4. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции нейтронов
1.6.5. Исследование изотопномеченных БАС методом спектроскопии комбинационного рассеяния
1.6.6. Исследование изотопномеченных БАС методом массспектрометрии ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение.
2.1. Получение штаммовпродуцентов БАС, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями экзогенной ОгО.
2.1.1. Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М.
2.1.2. Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. теуИсит
2.1.3. Адаптация бацилл В. яиЬИИз и В. ату1оиеайет
2.1.4. Адаптация галофильных бактерий Н. Иа1оЫит ЕТ
2.2. Изучение роста и биосинтеза БАС полученными штаммами.
2.2.1. Изучение ростовых характеристик М. Цаеа1ит на средах, содержащих СНзОНСЭзООСНзОН и 0
2.2.2. Получение штамма В. те1куИсшп, продуцента ЬРЬе
2.2.3. Исследование биосинтеза ЬРЬс метилотрофными бактериями В. тыИуИсит
2.2.4. Изучение влияния 0 на ростовые и биосинтетические характеристики В. теИуПсит
2.2.5. Исследование роста адаптированного штамма В. тыИуНсит и биосинтеза ЬРИе в максимально дейтерированной среде
2.2.6. Изучение качественного и количественного состав аминокислот суммарных белков биомассы В. тыкуИсит
2.2.7. Сравнительный анализ состава белков при росте В. тегкуИсит в максимально дейтерированной среде
2.2.8. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. зиЬШй на средах, содержащих ЭгО и гидролизаты метилотрофных бактерий
2.2.9. Изучение состава внутриклеточных сахаров В. ыЫШз
2.2.9.1. Изучение липидных профилей В. эиЬйШ
2.3. Анализ природы адаптационных процессов к 0 в клетке.
2.3.1. Теоретический анализ процессов адаптации клетки к 0
2.4. Изучение уровней включения дейтерия и ,3С в молекулы секретируемых аминокислот В. теОгуИсшп и М. АаеИаШт.
2.4.1. Получение препаратов культуральных жидкосгей, содержащих секретируемые дейтерий и Саминокислоты
2.4.2. Получение метиловых эфиров Опваминокислот и 2производных
аминокислот
2.4.3. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных
аминокислот В. текуИсит
2.4.4. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных
аминокислот В. тегкуИсит на ОгОсодержащих средах
2.4.5. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных
аминокислот В. тыкуИсит на средах, содержащих максимальные концентрации Э
2.4.6. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислоты за счт конверсии СОзОО
2.4.7. Исследование степеней включения ,3С в секретируемые аминокислоты М. Ааеа1ит за счт конверсии ,3СНэОН
2.5. Изучение уровней включения дейтерия и С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы В. теМуИсит и М.
2.5.1. Выделение дейтерий и 3Саминокислот из белковых гидролизатов
2.5.2. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. те1куИсит на 0содсржащих средах
2.5.3. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. те1куксит на средах, содержащих максимальные концентрации 0
2.5.4. Исследование степеней включения ,3С в аминокислоты М. за счт
биоконверсии 3СНзОН
2.6. Исследование возможности использования гидролизатов дейтериймеченной биомассы В. те1куИсит в качестве субстратов для получения Г,3,4,2,8 инозина.
2.6.1. Получение Г,3,4,2,8инозина
2.6.2. Исследование степени дсйтерированности инозина
2.7. Разработка способов получения дейтериймеченного бактериородопсина.
2.7.1. Получение дейтериймеченного бактериородопсина
2.7.2. Гидролиз дейтериймеченного ЬЯ
2.7.3. Исследование степени дейтерированности ЬРЬе, ЬТуг и ЬТгр в
бактериородопсине
2.7.4. Исследование степени дейтерированности ЬРйе, выделенного из
гидролизата ЬЯ
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.
3.1. Материалы
3.2. Бактериальные штаммы
3.3. Условия адаптации
3.4. Питательные среды
3.5. Методы
3.6. Очистка полученных соединений
3.7. Идентификация полученных соединений
3.8. Методы анализа полученных БАС
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Изотопномсчснные аналоги Ьфенилаланина и Ьтирозина, которые входят в состав пептидных гормонов, важны для нейрохимии и находят в настоящее время все большее применение в диагностических целях, например, для выявления наследственной фенилкстонурии и других заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма аминокислот в организме 7. Следует подчеркнуть, что использование дейтерированных соединений в биохимических исследованиях посравнению с их ,3С и 5К аналогами может быть несколько ограничено вследствие значительного изотопного эффекта дейтерия 8. БАС в водных растворах или при ферментативном расщеплении молекулы. Что касается диагностического использования Юаминокислот, то они находят применение в биохимических и клинических исследованиях при степенях изотопного обогащения не ниже 9. Значительным преимуществом применения Юаминокислот для биомедицинских целей в отличие от их дейтерированных аналогов является то, что Юаминокислоты могут стабильно существовать в плазме крови в течении нескольких дней, например, обратный изотопный обмен ЮЮ в молекуле ,тирозина усиливался при длительной инкубации кровяных клеток с питательной средой . Однако, высокая стоимость изотопных соединений кислорода представляет значительное препятствие их использованию для этих целей. Использование меченных БАС в структурнофункциональных исследованиях. Одной из центральных областей применения стабильномеченных аминокислот является исследование конформации биологически активных пептидов методами ЯМРспсктроскопии, химических и динамических свойств индивидуальных остатков аминокислот в белках, при расшифровки сложных областей спектров ЯМР с целью отнесения сигналов протонов аминокислот, а также для изучения взаимодействия БАС с рецепторами и другими молекулами, важными в проявлении биологических свойств природных соединений. Интенсивное развитие изотопночувствительной техники, прежде всего спектроскопии ядерного магнитного резонанса ЯМР , лазерной спектроскопии , инфракрасной ИК спектроскопии и массспектрометрии МС за последние годы позволило значительно усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований с пооу а также изучать и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне более подробно об этом в след, главе. В частности, меченные аминокислоты в настоящее время широко применяются для исследования путей их метаболизма и биосинтеза в клетке. Использование аминокислот, а также других БАС, меченных стабильными изотопами, в значительной мере определяется ограниченной доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из природных источников. С, однако, несмотря на низкое содержание изотопов разработанные в последние годы методы обогащения и очистки стабильных изотопов позволяют получать меченные субстраты высокой степени изотопной чистоты. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕННЫХ БАС. Химические синтезы изотопномеченных БАС. Методы получения изотопномеченных БАС на примере аминокислот показаны на рис. Рис. Методы получения изотопномеченных БАС. Химические синтезы аминокислот, меченных стабильными изотопами О, ,3С, Ы широко освещены в работах Дауба . В частности, в них продемонстрированы общие синтетические подходы по получению 3Смеченных аминокислот по карбоксильнымСООН и Са положениям молекул, и покана перспективность синтетических подходов. Несмотря на это химические синтезы вс же часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченных субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь 1и Ьформ аминокислот, для разделения которых требуются специальные методы очистки. С в боковые позиции молекулы аминокислоты, так чтобы каждая стадия химического синтеза была бы развита детально. Разработанные синтетические методы введения ,3Сметки в аминокислоты затрагивают, как правило, такие положения в молекулах аминокислот, как метильная группа метионина , Сг кольцевое положение в молекуле гистидина , а также атомы углерода при карбоксильных группах аспарагиновой , и глутаминовой кислот . Более тонкие синтезы стабильно меченных аминокислот были, как правило, связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.214, запросов: 145