Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов

Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов

Автор: Алексанкин, Андрей Павлович

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 127 с.

Артикул: 3307498

Автор: Алексанкин, Андрей Павлович

Стоимость: 250 руб.

Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Токсины энтеробактерий.
1.1.1. Энтеротоксины
1.1.1.1. БТэнтеротоксины.
1.1.1.2. Термолабильный энтеротоксин
1.2. Распространение способности токсинообразования среди различных групп микроорганизмов.
1.3. Методы культивирования токсигенных эшерихий
1.4. Методы выделение и очистки термолабильного энтеротоксина
1.5. Методы обнаружения термолабильного энтеротоксина.
1.5.1. Методы биологического обнаружения термолабильного энтеротоксина
1.5.2. Иммунохимические методы диагностики термолабильного энтеротоксина
1.5.3. Другие методы детекции термолабильного энтеротоксина.
1.6. Моноклональные антитела
Глава 2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы.
2.1.1. Штаммы бактерий
2.1.2. Лабораторные животные
2.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов и клеточных культур
2.1.4. Буферные растворы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Получение биомассы штамма продуцента
термолабильного энтеротоксина
2.2.2.1. Получение препаратов термолабильного
энтеротоксина ультразвуком.
2.2.1.2. Экстракция термолабильного энтеротоксина из клеток продуцентов 8М мочевиной
2.2.1.3. Выделение термолабильного энтеротоксина с использованием лизоцима.
2.2.2. Осаждение термолабильного энтеротоксина сульфатом аммония.
2.2.3. Гельфильтрация.
2.2.4. Аффинная хроматография
2.2.5. Определение концентрации белка
2.2.6. Электрофорез в ПААГе
2.2.7. Иммуноблотинг.
2.2.8. Определение антигенной активности.
2.2.9. Реакция радиальной иммунодифузии по
Ухтерлони
2.2 Тест на биологическую активность термолабильного энтеротоксина.
2.2 Получение поликлональных антител.
2.3. Методы работы с культурами клеток.
2.3.1. Клонирование гибридом.
2.3.2. Хранение клеток.
2.3.3. Размораживание клеток.
2.3.4. Получение препаративного количества мкАт
2.3.5. Очистка мкАт с помощью ионообменной хроматографии.
2.4. Иммуноферментный анализ.
2.4.1. Приготовление конъюгата мкАт и поликлональных антител
с пероксидазой хрена.
2.4.2. Приготовление проявляющего раствора.
2.4.3. Непрямой метод иммуноферментного анализа
2.4.4. Двухцентровой метод иммуноферментного анализа.
2.4.5. Определение токсигенности бактериальных штаммов
2.5. Иммунохроматографический анализ.
Глава 3. Результаты исследований.
3.1. Выделение и очистка термолабильного энтеротоксина эшерихий
3.1.1. Получение биомассы штамма продуцента.
3.1.2. Получение грубыхэкстрактов штамма продуцентов.
3.1.3. Фракционирование грубого экстракта сульфатом аммония .
3.1.4. Очистка препарата энтеротоксина посредство гель фильтрации.
3.1.5. Аффинная хроматография на голубой агарозе
3.1.6 Определение чистоты полученных препаратов
термолабильного энтеротоксина
3.1.7. Определение антигенной активности термолабильного энтеротоксина
3.1.8. Определение биологической активности термолабильного энтеротоксина
3.1.9. Определение специфичности мкАт с использованием иммуноблотинга.
3.2. Получение поликлональной антисыворотки против
термолабильного энтеротоксина
3.2.1. Выделение и очистка поликлональных антител из антитоксической сыворотки
3.2.2. Хроматография поликлональной сыворотки на ОЕАЕ ТоуореагМ
3.2.3. Определение специфичности препаратов поликлональных антител
3.2.4. Получение конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой хрена.
3.2.5. Подбор оптимальных условий для сорбции поликлональных антител на пластик.
3.3. Получение и очистка препаративных количеств мкАт.
3.3.1. Использование перитониальных макрофагов.
3.3.2. Получение препаративных количеств мкАт
3.3.3. Хроматографическая очистка мкАт на сорбенте ОЕАЕТоуореаН ОМ
3.3.4. Определение чистоты полученных препаратов мкАт
3.3.5. Исследования используемых мкАт методом ИФА
3.3.5.1. Получение конъюгатов мкАт с пероксидазой хрена.
3.3.5.2. Подбор специфической пары мкАт для обнаружения термолабильного энтеротоксина
3.3.5.3. Определение оптимальных условий сорбции мкАт
на иммунологические планшеты.
3.4. Создание иммуноферментной тестсистемы для определения термолабильного энтеротоксина.
3.4.1. Аналитические параметры иммуноферментной тестсистемы
для обнаружения термолабильного энтеротоксина.
3.5. Определение термолабильного энтеротоксина при помощи иммунохроматографического анализа.
3.6. Испытание иммуноферментной тест системы
3.6.1. Анализ бактериальных штаммов на токсинообразование
3.6.2. Определение термолабильного энтеротоксина в кормах
3.6.3. Определение термолабильного энтеротоксина
в биологических образцах
Глава 4. Обсуждение результатов.
Выводы
Библиографический список
Приложения.
Список сокращений
АГ антиген
АЖ асцитицеская жидкость АМФ аденозинмонофосфат АТ антитело
АТч антитела к энтеротоксину .i человеческого происхождения
АТс антитела к энтеротоксину .i свиного происхождения
ББР боратный буферный раствор
БСА бычий сывороточный альбумин
ГГФРТ гипоксантингуанозинфосфорибозилтрансфераза
, , ганглиозиды
Ддальтон
ДЦС додецилсульфат натрия
ДЭАЭ диэтиламиноэтил целлюлоза
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
I i i
ЕОП единицы оптической плотности
ЗФР забуференный физиологический раствор
ИГ иммуноглобулин
I иммуноглобулин
ИОХ ионообменная хроматография
ИФА иммуноферментный анализ
ИХА иммунохроматографический анализ
ИЭФ изоэлектрическое фокусирование
КВ коэффициент вариации
КД килодальтон
ЛПС липополисахарид
термолабильный энтеротоксин
термолабильный энтеротоксин человека
термолабильный энтеротоксин свиней
ЛуриаБертани
М.В. молекулярный вес
мкАт моноклональные антитела
маннозорезистивные
маннозочувствительные
ОКЗ острые кишечные заболевания
ОФД ортофенилдиамин
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
РИА радиоиммунный анализ
РНК рибонуклеиновая кислота
СТ термостабильный энтеротоксин эшерихий
СФ сульфатная фракция
ТМБ тетраметилбензидин
фактор колонизации ii i
гипоксантинаминоптеринтимидин
гипоксантинтимидин
X холерный токсин
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭИКП энтероинвазивные кишечные папочки
ЭПКП энтеропатогенные кишечные палочки
ЭТКП энтеротоксигенные кишечные палочки
сыворотка плода коровы
СБС среда без сыворотки
ПХ пероксидаза хрена
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В настоящее время во многих районах земного шара острые диарейные заболевания остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Причинами роста распространенности кишечных инфекций является увеличение спектра микроорганизмов, которые вызывают развитие инфекционных процессов и целый ряд факторов, способствующих повышению вирулентных свойств условнопатогенной микрофлоры. Установлено, что изменения патогенности у бактерий реализуются на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации В. М. Бондаренко, . Если раньше наиболее известными возбудителями острых кишечных инфекций были Vii , а также патогены из родов i и , то в настоящее время все большее этиологическое значение приобретают условнопатогенные энтеробактерии в том числе и ii i А. Р. Мавсютов, С. В. Фиалкина, . Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины термолабильный и термостабильный I, II энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами Ю. В. Вертиев В. В большинстве случаев от токсикоинфекций страдает молодняк сельскохозяйственных животных, а также пушных зверей. Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству Д. Д. Новак, Т. А. Гришина, И. И. Сидорчук и др. Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится их ранней диагностике. О.А. Полякова, , возникает необходимость определения энтеротоксина. Большинство соответствующих биологических тестов трудоемки, характеризуются низкой чувствительностью, неудовлетворительной воспроизводимостью результатов. В случае энтеротоксинов эшерихий это биопроба на мышахсосунках . Вартанян и др. Применяемые для определения тесты на культурах клеток , . Вышеперечисленных недостатков лишены иммунохимические методы определения энтеротоксинов. Оптимальной, на наш взгляд, является разработка иммуноферментных тестсистем ИФА и радиоиммунологических тестсистем РИА для определения энтеротоксинов. ИФА, так же как и РИА, намного более специфичен и чувствителен, чем биологические методы или методы, основанные на преципитации, но не требует применения радиоактивных реагентов. Идеальным инструментом для создания подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихий являются моноклональные антитела мкАт. В настоящее время за рубежом получены мкАт к и энтеротоксинам эшерихий М. Разработаны также твердофазный метод ИФА для определения энтеротоксина на основе мкАт и РИА системы для определения и энтеротоксинов . Учитывая все вышеизложенное, целью нашего исследования является разработка иммунохимических методов для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. Оптимальным в данном случае является создание иммуноферментного диагностикума с использованием специфических моноклональных антител. Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка на основе оригинальных мкАт иммуноферментной тестсистемы для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. Задачи исследования. Выделить и очистить препаративное количество термолабильного энтеротоксина эшерихий. Получить и очистить мкАт к термолабильному энтеротоксину в препаративных количествах. Изучить возможность создания иммунохроматографической тестсистемы ИХА на основе мкАт. Разработать на основе мкАт специфическую и высокочувствительную иммуноферментную тестсистему для качественного определения термолабильного энтеротоксина. Провести лабораторные испытания разработанной иммуноферментной тестсистемы. Научная новизна исследования. С целью увеличения выхода высокоочищенного термолабильного энтеротоксина эшерихий модифицирована схема его выделения и очистки. Показана принципиальная возможность разработки на основе мкАт иммунохроматографического диагностикума для определения термолабильного энтеротоксина. Впервые разработана с использованием оригинальных мкАт иммуноферментная тестсистема для качественного определения термолабильного энтеротоксина.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.185, запросов: 145