Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста

Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста

Автор: Мишуткина, Яна Владимировна

Год защиты: 2007

Место защиты: Москва

Количество страниц: 136 с. ил.

Артикул: 3371437

Автор: Мишуткина, Яна Владимировна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ
2. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
3. ВВЕДЕНИЕ
4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
4.1 Биология и особенности селекции сахарной свеклы
vi .
4.2 Основные этапы генетической трансформации и получения генетически модифицированного растения ГМР
4.2.1 Культура клеток и морфогенез растений i vi.
4.2.2 Влияние генотипа растения на компетентность к регенерации
i vi
4.2.3 Влияние типа и состояния экспланта на морфогенез i vi
4 4.2.4 Влияние компонентов питательной среды на морфогенез
растений i vi.
4.2.5 Влияние условий культивирования клеток и тканей на
процессы морфогенеза
4.3 Клональное микроразмножение растений
4.4 Генетическая трансформация растительных клеток
4.4.1 Способы генетической трансформации растений
4.4.2 Молекулярные механизмы и факторы влияющие на агробактериальную трансформацию
4.4.3 Векторные системы на основе iплазмид.
4.4.4 Бактериальные штаммы.
4.4.5 Гены, используемые для трансформации.
4.4.6 Селекция как этап трансформации
4.5 Сахарная свкла как объект генноинженерных манипуляций
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
5.1 Растительный материал.
5.2 Методы культивирования сахарной свеклы i vi.
5.2.1 Состав сред и условия культивирования
5.2.2 Получение стерильного растительного материала
5.2.3 Изоляция сегментов гипокотиля и индукция образования каллуса
5.2.4 Регенерация побегов из морфогенного каллуса
5.2.5 Изоляция семядолей и индукция образования каллуса
5.2.6 Индукция образования побегов из семядольных узлов
5.2.7 Клональное микроразмножение
5.2.8 Индукция регенерации побегов из черешков листа.
5.2.9 Укоренение побегов и адаптация растений к почвенным
условиям
5.3 Культура агробактерии.
5.3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.
5.3.2 Подготовка агробактериальной культуры к трансформации.
Ф 5.4 Трансформация и селективный отбор растений
5.4.1 Сокультивация эксплантатов с i i
5.4.2 Определение оптимальной концентрации селективного агента
5.5 Молекулярногенетический анализ.
5.6 Определение свечения
5.7 окрашивание.
5.8 Анализ устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста
5.9 Статистическая обработка данных.
6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
6.1 Получение стерильного растительного материала.
6.2 Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов i vi
6.2.1 Индукция образования каллуса
6.2.2 Индукция образования каллуса из семядолей.
6.2.3 Регенерация побегов из морфогенного каллуса.
6.2.4 Регенерация побегов из семядольного узла
6.2.5 Клональное микроразмножение побегов.
6.2.6 Регенерация побегов из черешка листа
6.3 Оптимизация параметров укоренения побегов i vi и адаптация
растений из культуры i vi к условиям искусственного климата.
6.4 Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерных генов
6.5 Определение оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина i vi
6.6 Получение трансгенных растений сахарной свеклы с геном
6.7 Оценка устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста
6.8 Разработка селекционного процесса с участием трансгенной составляющей.
7. ВЫВОДЫ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ
Рисунок 1. Данные Росстата по производству сахарной свеклы и сахара
Рисунок 2. Типы морфогенетических процессов в культуре клеток и тканей i
Рисунок 3. Факторы, влияющие на морфогенез растений i vi
Рисунок 4. Влияние соотношения ауксинцитокинин на морфогенез растений
i vi
Рисунок 5. Модель агробактериальной трансформации Т. Тцфира и
В. Цитовский, .
Рисунок 6. Схема регенерации растений сахарной свеклы из морфогенного
каллуса, полученного из сегментов гипокотиля
Рисунок 7. Схема регенерации растений сахарной свеклы из морфогеиного
каллуса, полученного из семядолей.
Рисунок 8. Схема регенерации растений сахарной свеклы из семядольных
Рисунок 9. Схема клонального микроразмножепия растений сахарной свеклы
Рисунок . Схема регенерации растений сахарной свеклы из черешков
листьев.
Рисунок . Иллюстрация наличия А и отсутствия В РАТ фермента
i.
Рисунок . Влияние различных концентраций Белизны и времени
стерилизации на получение асептических растений сахарной свеклы
Рисунок . Схема эксперимента по изучению компетентности сахарной
свеклы к регенерации растений i vi
Рисунок . Образование каллуса на сегменте гипокотиля
Рисунок . Влияние генотипа и различных концентраций АБК на частоту
регенерации побегов из каллуса
Рисунок . Регенерация побегов из каллуса
Рисунок . Регенерация побегов из семядольного узла
Рисунок . Влияние различных концентраций кинетина, зеатина и БАП на
частоту индукции побегов из семядольного узла.
Рисунок . Микроразмноженные клоны сахарной свеклы i vi
Рисунок . Динамика клонального микроразмножения побегов сахарной
свеклы i vi.
Рисунок . Регенерация побегов из черешков листьев
Рисунок . Укорененные побеги сахарной свеклы в агаризованной среде и
перлите
Рисунок . Влияние генотипа и типа экспланта на частоту регенерации
побегов сахарной свеклы i vi
Рисунок . Транзиентная экспрессия гена в тканях сахарной свеклы
Рисунок . Выживаемость побегов на средах с различными концентрациями
фосфинотрицина.
Рисунок . Побеги сахарной свеклы после 6 недель селекции на различных
концентрациях фосфинотрицина 0,0,5, 1,2,4 и 8мгл
Рисунок . Электрофоретический анализ ПЦР продуктов побегов
прошедших селекцию на фосфинотрицине А на ген , Б на vген
Рисунок . Электрофоретический анализ ПЦР продуктов химерных
растений.
Рисунок . Электрофоретический анализ ПЦР продуктов растений,
прошедших селекцию на различных концентрациях фосфинотрицина.
Рисунок . Схема расхимеривания побегов сахарной свеклы.
Рисунок . Результаты анализа наличия фермента РАТ тестсистема i
i
Рисунок . Контрольные и трансгенные растения на среде с различными
концентрациями фосфинотрицина
Рисунок . Саузернблоттинг трансгенных растений.
Рисунок . Результаты выравнивания последовательности
амлифицированного фрагмента Х1 с последовательностью гена
Рисунок . Трансгенные и контрольные растения после обработкой
гербицидом Баста.
Рисунок . Схема селекционного процесса с трансгенной составляющей .
Таблица 1 Биотипы сахарной свеклы по признаку стерильности
фертильности пыльцы Балков И .Я. .
Таблица 2. Основные классы регуляторов роста растений РРР и их действие
в культуре клеток растений
Таблица 3. Сравнение способов генетической трансформации растений
Таблица 4. Примеры используемых селективных генов и селективных
агентов.
Таблица 5. Литературные данные по регенерации и трансформации сахарной
Таблица 6. Состав сред для культивирования клеток и тканей сахарной
свеклы i vi.
Таблица 7. Варианты стерилизации семян сахарной свеклы
Таблица 8. Вычисление статистических характеристик выборки по
количественной изменчивости признака
Таблица 9. Вычисление сумм квадратов отклонений, дисперсий и критерия
Таблица . Частота получения стерильных семян сахарной свеклы при
различных способах стерилизации.
Таблица . Частота получения стерильных проростков сахарной свеклы
Таблица . Влияние состава питательной среды и генотипа на частоту
индукции морфогенного каллуса из сегментов гипокотиля
Таблица . Влияние генотипа на частоту регенерации побегов из черешков
Таблица . Влияние состава среды на частоту укоренения побегов сахарной
свеклы i vi
Таблица . Влияние субстрата на увеличение массы растснийрегенерантов
Таблица . Влияние времени поранения, сокультивации в жидкой и на
твердых средах на частоту транзиентной экспрессии i
Таблица . Результаты экспериментов по получению трансгенных растений
сахарной свеклы с геном селекция на 2мгл РРТ.
Таблица . Результаты экспериментов по получению трансгенных растений
сахарной свеклы с геном селекция на 4,8 и мгл РРТ
Таблица . Результаты экспериментов по получению трансгенных растений
сахарной свеклы с геном селекция на мгл РРТ
щ Таблица . Оценка устойчивости трансгенных линий сахарной свеклы к
различным концентрациям фосфинотрицина i vi.
2. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
среда Мурасиге и Скуга i
5 среда Гамбурга и др.
питательная среда ii
ИУК I индолил3уксусная кислота
ИМК I индолил3масляная кислота
БАП 6бензиламинопурин
НУК онафтилуксусная кислота
ТИБК I 2,3,5трийодбензойиая кислота
ГК гиббереллиновая кислота
тидиазурон
регуляторы роста растений
2ii i
ген, кодирующий гигромицинфосфотрансферазу
ген, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансферазу
vi гены гены вирулентности агробактерии
фосфинотрицинацетилтрансфераза ФАТ
хлорамфениколацетил трансфераза
зеленый флюоресцирующий белок i
3глюкуронидаза 5i
канамицин
гигромицин
фосфинотрицин
карбенициллин
цефогаксим
рифампицин
x 5бром4хлор3индолил5глюкуронид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
микро
моль
миллимоль
ПЦР полимеразно цепная реакция
ПЭГ полиэтилен гликоль
V
тысяч пар нуклеотидов
Ii i Vii
3. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Методы генной инженерии отрыли возможность вводить в сахарную свеклу гетерологичные гены, улучшающие агротехнические свойства данной культуры, которые раннее невозможно было использовать в традиционной селекции. Создание устойчивых к гербицидам сортов и гибридов позволит решить проблему сорных растений, уменьшить время и частоту обработки полей и, тем самым, снизить экологическую нагрузку на окружающую среду
В течение последних 2х десятилетий с помощью генной инженерии были получены различные сельскохозяйственные виды растений устойчивые к гербицидам, в том числе и сахарная свекла 7, 8. Однако создание трансгенных линий до сих пор под силу только крупным международным биотехнологическим компаниям, инвестирующим большие средства в изучение молекулярногенетических основ данного процесса. В настоящее время существует ряд факторов, сильно ограничивающих возможности генетической трансформации этой культуры. Прежде всего, регенерация и трансформация сахарной свеклы является в значительной степени генотипзависимым процессом. Иностранные гибриды имеют ряд недостатков при выращивании в климатических условиях РФ неустойчивы к заболеваниям в поле, склонны к загниванию корнеплодов при хранении 9, . Это связано с тем, что сорт любой культуры обладает устойчивостью к патогенным организмам и вызываемым ими болезням для тех условий, в которых он был создан. Почвенноклиматические условия большинства европейских стран, в которых ведется селекция сахарной свеклы, существенно отличается от условий основных зон свеклосеяния Российской Федерации, как по видовому составу почвенной микрофлоры, так и но соотношению в ней грибов и бактерий, а также по активности патогенных организмов . К тому же гибриды иностранной селекции требуют большего периода вегетации и более высоких температур, чем климатические условия большинства свекловысевающих областей РФ. Данные факторы существенно влияют на заболеваемость иностранных сортов и гибридов. Создание сахарной свеклы устойчивой к гербицидам общего действия на основе сортов и гибридов Российской селекции даст возможность сократить потери урожая и увеличить доли отечественного сырья на российских сахарных заводах. Кроме того, применение гербицид устойчивых гибридов позволить снизить экологическую нагрузку на окружающую среду. В результате этого российская сахарная промышленность сможет постепенно заменить используемого сахарасырца на отечественное сырье. Все сказанное выше показывает необходимость разработки систем регенерации и генетической трансформации сортов и гибридов отечественной селекции с целью создания растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам. Этой главной цели и посвящена настоящая работа. Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной компетентности сортов и линий сахарной свеклы vi . Баста Либерти. Дальнейшее включение таких растений в селекционный процесс приведет к созданию гербицидустойчивых сортов и гибридов. Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию ростовых регуляторов и тип эксплантата с целью получения регенерации побегов i vi с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации. Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации сахарной свеклы, используя для оценки системы транзиентной экспрессии маркерных генов. Разработать методику негативной селекции трансгенных клеток сахарной свеклы i vi, основанную на устойчивости к фосфинотрицину действующему веществу гербицида Баста, определяемую экспрессией гена . Получить трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген , обуславливающий устойчивость к гербициду Баста, и определить наличие экспрессии данного гена. Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста. Научная новизна. Разработан эффективный способ прямой регенерации побегов из семядольных узлов достигнутая частота регенерации составила, в зависимости от генотипа, . На основе этого способа регенерации разработана оригинальная система генетической трансформации с использованием i i.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.230, запросов: 145