Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах

Разработка тест-системы ИФА для определения дексаметазона в биологических субстратах

Автор: Вылегжанина, Александра Владимировна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Москва

Количество страниц: 161 с. ил.

Артикул: 3313419

Автор: Вылегжанина, Александра Владимировна

Стоимость: 250 руб.

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Стимуляторы роста.
2.2. Кортикостероиды.
2.3. Дексаметазон
2.4. Фармакокинетика дексаметазона.
2.5. Фармакодинамика дексаметазона.
2.6. Определение приемлемой суточной дозы потребления ДМ.
2.7. Расчет максимально допустимого уровня остатков ДМ
2.8. Период ожидания после применения ДМ
2.9. Скринингметоды
2 Иммуноферментный анализ ИФА
2 Гетерогенный ИФА
2 Принципы иммобилизации биомолекул.
2 Ферментативные метки в ИФА
2 Выбор подходящего субстрата в ИФА.
2 Арбитражные методы
2 Предел определения метода
2 Получение иммуногенов и иммунореагентов.
2 Иммунная система млекопитающих.
2 Синтез АГ
2 Количество АГ для иммунизаций.
2 Основные свойства адъювантов
2 Выбор адъюванта
2 Выбор животного для продукции поликлональных АТ.
2 Пути введения и количество инъекций для первичной иммунизации
2 Повторные поддерживающие иммунизации
2 Программы иммунизаций.
2 Определение следов органических соединений
2 Жидкостножидкостная экстракция
2 Технология экстракции.
2 Методы экстракции дексаметазона.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Используемые реактивы и материалы
3.2. Методы исследований
3.2.1. Получение гаптена и конъюгатов дексаметазона с белками
3.2.2. Получение специфических поликлональных сывороток
3.2.3. Сенсибилизация лунок планшета
3.2.4. Определение активности иммунных сывороток.
3.2.5. Определение специфичности и константы аффинности иммунных сывороток.
3.2.6. Определение специфичности тестсистемы
3.2.7. Определение концентрации белка по методу Лоури.
3.2.8. Экстракция ДМ из биологических субстратов
3.2.8.1. Подготовка образцов мышечной ткани КРС.
3.2.8.2. Подготовка образцов мышечной ткани свиньи
3.2.8.3. Подготовка образцов печени
3.2.8.4. Подготовка образцов почек.
3.2.8.5. Подготовка образцов мочи
3.2.8.6. Подготовка образцов корма
3.2.8.7. Подготовка образцов молока.
3.2.9. Проведение ВЭЖХМСМС анализа.
3.2 Определение концентрации ДМ в исследуемых образцах.
3.2 Определение эффективности экстракции ДМ из биологических субстратов
3.2 Расчет метрологических характеристик НТК ИФА
3 Расчет пределов обнаружения и определения ДМ в образцах
3 Воспроизводимость результатов анализа
3 Сходимость результатов анализа.
3.2 Обработка данных.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Получение специфических иммунореагентов
4.2. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА
4.2.1. Получение специфических иммунных сывороток
4.2.2. Определение активности иммунных сывороток в НТ ИФА
4.2.3. Определение специфичности иммунных сывороток в НТК ИФА
4.2.4. Определение констант аффинности АТ в НТК ИФА
4.2.5. Выбор ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета
4.2.6. Выбор оптимальной концентрации ТФА
4.2.7. Определение оптимального времени сенсибилизации и оптимальной температуры инкубации ТФА с полистиролом.
4.2.8. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА
4.2.9. Определение оптимального времени и температуры инкубации ТФА
с АТ в НТК ИФА.
4.2 Определение чувствительности предлагаемого метода для определения ДМ.
4.2 Определение специфичности тестситемы
4.2 Заключение.
4.3. Разработка способов подготовки биологического материала для определения ДМ методом ИФА.
4.3.1. Экстракция метанолом и смесью метанолвода с последующей очисткой гексаном и экстракцией аналита из водного в эфирный слой
4.3.2. Экстракция хлороформом из органов и тканей при различных
1,0 5,2 7,0 исходного образца
4.3.3. Экстракция смесью ацетонитрилвода , с последующей очисткой экстракта в системе гександихлорметан
4.3.4. Определение ДМ в молоке.
4.3.5. Заключение
4.4. Комиссионные испытания.
4.5. Определение ДМ в продукции животноводства и кормах методом жидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектированием
4.5.1. Проведение ВЭЖХМСМС анализа
4.5.2. Заключение.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
6. ВЫВОДЫ.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ.
9. ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ антиген
АТ антитело
БСА бычий сывороточный альбумин
БС АГсДМ конъюгат дексаметазон гемисукцината с БСА
БСАГсЖ конъюгат дексаметазон гемисукцината с Ж
БС АГ сКС А конъюгат дексаметазон гемисукцината с КСА
БСАГсЯА конъюгат дексаметазон гемисукцината с ЯА
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
высокоэффективная жидкостная хроматография тан
ВЭЖХМСМС
демная массспектрометрия ГХМС газовая хроматография массспектрометрия
ДМ дексаметазон
Ж желатина
ЖЖЭ жидкостножидкостная экстракция
концентрация АГ, обеспечивающая ингибирова
ние связывания АТ ИФА иммуноферментный анализ
ИЭР ионизация электрораспылением
Каф константа аффинности
КРС крупный рогатый скот
КСА кроличий сывороточный альбумин
МДУ максимально допустимый уровень
мз соотношение массы к заряду молекулы
МНР мониторинг нескольких реакций
НТ ИФА непрямой тврдофазный иммуноферментный анализ
НТК ИФА непрямой тврдофазный конкурентный ИФА
оптическая плотность, измеренная при длине волны
0 нм
ПАФ полный адъювант Фрейнда
РИА радиоиммунный анализ
ГБМЭ третбутилметиловый эфир
ТМБ 3,,5тетраметилбензидин
ТФА тврдофазный антиген
ТФЭ тврдофазная экстракция
ЯА яичный альбумин
иммуноглобулин в
САТ процент связывания АТ
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Анаболические стимуляторы включают несколько подгрупп, в которые
входят эндогенные и синтетические стероидные гормоны, триостатики, произ,1 водные стильбена и Радреностимуляторы 8. По химической структуре стероидные гормоны это класс гидрофобных органических веществ, образующихся в ходе ферментативного синтеза из холестерола в коре надпочечников. Основные гормоны, синтезируемые и секретируемые корой надпочечников, это кортикостероиды, эстрогены и андрогены . Обычно стероиды имеют в составе своей молекулы стерановое кольцо из углеродных атомов с различными заместителями и боковую алкильную цепочку рис. Стероидные гормоны относятся к липофильным сигнальным веществам, местом их действия являются ядра клетокмишеней. В крови стероидные гормоны обычно бывают связаны с транспортными белками. Однако через плазматическую мембрану проникает лишь свободный гормон. В цитоплазме или в клеточном ядре гормон взаимодействует со специфическим рецептором. Ключевой стадией процесса гормональной регуляции является связывание димеров гормонрецепторного комплекса с двунитевой ДНК. Каждый гормонрецепторный комплекс узнает собственный участок связывания и инициирует транскрипцию лишь одного контролируемого этим участком гена 6. В дальнейшая нумерация заместителей и боковой цепи 0. Различие между стероидами и кортикостероидами заключается в отличиях боковой цепи, начиная с С атома гидроксигруппы на атоме С0 и С и кетогруппа на С. Синтетические кортикостероиды создаются с усиленной глюкокортикоидной активностью. Это достигается путем дегидратации связи А 1,2, гидроксилирования или метилирования атома С и галогенирования С6 иили С9 атомов 4. Минералокортикоиды. Минералокортикоиды альдостерон и др. Глюкокортикоиды кортизон, кортизол оказывают влияние на углеводный, белковый и жировой обмен. Глюкокортикоиды также обладают выраженными противовоспалительными свойствами. Большинство из кортикостероидов обладает способностью влиять на электролитный баланс и пластический обмен в большей или меньшей степени. Разделение на минералокортикоиды и глюкокортикоиды зависит от их наиболее значимой активности . Единственное клиническое использование минералокортикоидов в животноводстве это заместительная терапия в случае неадекватности адренонадпочечниковой системы. Тогда как кортикостероиды, обладающие потенцированными глюкокортикоидными свойствами, влияют на большое количество физиологических и патологических процессов и, следовательно, очень широко применяются в ветеринарной практике . Основное применение глюкокортикоидов в терапевтических целях связано с их антивоспалительным и иммуносу ппрессорным действием. Глюкокортикоиды снижают ответ соединительной ткани на травматические и анафилактические повреждения 4. Они подавляют клиническое проявление болезней скелетномышечной системы, таких как артриты расстройства желудочнокишечного тракта, почечные расстройства, кожные болезни, астму, сердечные болезни. Соединения этой группы используются при трансплантации органов и тканей, глазных и неврологических расстройствах 8. У сельскохозяйственных животных глюкокортикоиды используются при лечении кетоза и многих других заболеваний. Главное ограничение терапевтического применения глюкокортикоидов множество побочных эффектов. Вводить вещество можно перорально, внутримышечно, подкожно, внутривенно или с помощью местного нанесения 3. Синтетические аналоги глюкокортикоидов дексаметазон, бетаметазон, преднизолон, метилпреднизолон, флуметазон, изофлупредон, флунизонид, триамциналон ацетонид, триамциналон, преднизон, бетаметазон и др. Среди совсем недавно обнаруженных веществ можно отметить клобетасолпропионат и баклометасонедипропионат . Влияние и эффекты глюкокортикоидов на углеводный, белковый и жировой обмен. Кортизол увеличивает интенсивность глюконеогенеза превращение аминокислот из белков в глюкозу и уменьшает интенсивность периферической утилизации глюкозы. Это приводит к тому, что в тканях начинает накапливаться гликоген гликогенезис, особенно в печени. Уровень печеночного гликогена увеличивается за счет жирового метаболизма и белкового катаболизма .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.206, запросов: 145