Биологические свойства клеточного (PrP c ) и инфекционного (PrP Sc ) прионового протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток

Биологические свойства клеточного (PrP c ) и инфекционного (PrP Sc ) прионового протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток

Автор: Дагданова, Аюна Владимировна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2002

Место защиты: Москва

Количество страниц: 344 с. ил

Артикул: 2313406

Автор: Дагданова, Аюна Владимировна

Стоимость: 250 руб.

Биологические свойства клеточного (PrP c ) и инфекционного (PrP Sc ) прионового протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток  Биологические свойства клеточного (PrP c ) и инфекционного (PrP Sc ) прионового протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток 

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Общая характеристика приоиового протеина
2.2. Функции приоиового протеина.
2.3. Нейродегенеративные болезни животных, вызываемые прионами, и
некоторые вопросы патогенеза
2.4. Трансгенные животные как модель изучения прионных
болезней
2.5. Культуры клеток для изучения прионов
2.6. Детекция прионов
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы и методы.
3.1.1. Материалы
3.1.2. Методы
3.2. Результаты собственных исследований.
3.2.1. Изучение экспрессии клеточного приоиового протеина РгР в культурах клеток моноцитов человека и мыши клетки мононуклеарной линии моноциты макрофаги микроглия и
активации различных сигнальных трансдукционных каскадов.
3.2.1.1. Предварительные эксперименты. Определение активации МАРкиназ и тирозинкиназ в клеточных линиях моноцитов человека ТНР1 и мыши А1, Р
3.2.1.2. Определение экспрессии РгР в клеточных линиях моноцитов человека ТНР1 и мыши А.1, Р1.
3.2.1.3. Определение экспрессии РгР в моноцитах человека и мыши в ответ на длительную стимуляцию липополисахаридом ЬР5 и конканавалином А СопА.
3.2.2. Создание стабильно трансфицированных геном прионового протеина Ргпрген дикого типа гомологичных систем мышиных моноцитов.
3.2.2.1. Предварительные эксперименты определение оптимального способа трансфекции моноцитов посредством транзиентной трансфекции рекомбинантной конструкцией рЮСКБ с СтУРгеном.
3.2.2.2. Стабильная трансфекция моноцитов мыши А1 и Р1 рекомбинантной конструкцией рС1пео с гигеном.
3.2.2.2.1. Изолирование резистентных к клонов моноцитов, определение экспрессии РгРс
3.2.2.2.2. Изучение процессов метаболизма РгРс в моноцитах в клетках мононуклеарной линии на примере трансфицированных моноцитов мыши Р8Э1РгР
3.2.2.2.2.1. Удаление Ыгликанов, связанных с амидной группой аспарагина в РгР .
3.2.2.1.2.2. Определение молекулярной массы и процентного
отношения ДСТРгР к РгР в трансфицированных моноцитах Р8В1РгР.
3.2.2.1.2.3. Выявление фрагментов прионового протеина в культуральной среде.
3.2.3. Изучение роли РгРс в активации различных сигнальных трансдукционных каскадов в клетках мононуклеарной линии на модели трансфицированных моноцитов Р8П1РгР
3.2.3.1. Изучение роли РгРс в активации МАРкиназы р при и СопА стимуляции
3.2.3.2. Определение роли РгРс в инициации тирозинкиназозависимых внутриклеточных сигнальных трансдукционных каскадов через детекцию фосфорилированных по тирозину протеинов.
3.2.3.3. Определение возможности ингибирования каскадов сигнальной трансдукции с использованием ингибитора гирозинкиназ семейства.
3.2.4. Изучение роли РгРс в антиоксидантной защите
3.2.4.1. Определение уровня экспрессии РгРс в 3х мерной суспензионной культуре 3 многоклеточных опухолевых сфероидов предстательной железы человека 5.
3.2.4.2. Определение экспрессии , 1 и каталазы
3.2.4.3. Изучение локализации РгРс и антиоксидантных ферментов.
3.2.4.4. Определение уровня внутриклеточного редокспотенциала и экспрессии РгРс в сфероидах разного размера.
3.2.4.5. Изучение регуляции экспрессии РгРс модуляцией уровня внутриклеточных и воздействиехМ ингибиторов свободных радикалов.
3.2.5. Выявление клеточного прионового протеина РгРс и агента скрепи в культурах клеток сельскохозяйственных животных из Коллекции клеточных культур СХЖ РАСХН и криобанка ВИЭВ и культурах клеток, инфицированных агентом скрепи
3.2.5.1. Иммуноцитохимическая детекция в инфицированных культурах клеток с использованием первичных моноклональ
ных антител и вторичных антивидовых антител, меченых щелочной фосфатазой.9
3.2.5.2. Детекция РгР и РгР в культурах клеток с использованием первичных моноклональных антител и вторичных антивидовых антител, меченых пероксидазой хрена1
3.2.5.3. Детекция РгР и РгР в культурах клеток из Коллекции клеточных культур СХЖ РАСХН и криобанка ВИЭВ
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БА болезнь Альцгеймера
ВРП внутриклеточный редокспотенциал
Иммуногистохимический метод ИГХ
Иммуноцитохимический метод ИЦХ
ИЦ интрацеребральная инокуляция
ИП интраперитонеальная инокуляция
КТ комнатная температура
ЛРС лимфоретикулярная система
МКАТ моноклональное антитело
МКМ мясокостная мука
ОС опухолевые сфероиды 3мерная суспензионная культура многоклеточных опухолевых сфероидов предстательной железы человека
ПНС периферическая нервная система
ЦНС центральная нервная система
3 трехмерная культура
АА i акриламид
i i болезнь Альцгеймера БА
АЕС 3i
АР i щелочная фосфатаза
3iixi
i персульфат аммония
,,i2x2ii i
i,пары оснований
vi i бычий сывороточный альбумин
vi i трансмиссивная губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота ТГЭ крупного рогатого скота
I 3i4ii
ii xii
СССР
i болезнь КрейтцельдаЯкоба БКЯ
vi А конканавалин А
i i i хроническая изнуряющая болезнь, содержащихся в неволе лосей и оленей
дальтон
дегидроаскорбиновая кислота
ii, диметилформамид
ixi диметилсульфоксид
x
I i ii i
v ii Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток
iii дитиотреитол
ii i
iii i этилендиаминтетрауксусная кислота
xi спонгиоформная энцефалопатия экзотических копытных
ii семейная
фетальная сыворотка крупного рогатого скота
i ii фолликулярные дендритные разветвленные клетки
I ii ii летальная семейная бессоница
i i спонгиоформная энцефалопатия кошачьих
I i ii летальная спорадическая бсссоница
генетицин
Iiii ii гликозилфосфатидилинозит
i зеленый флюоресцирующий протеин
i i синдром ГерштманнаШтройслера.
2 iii i, диацетат дихлородигидрофлюоресцеина
i i
2xii2i i
I сыворотка лошади
i ii ятрогенная
I1 ii
буфер iiбуфер
ii липополисахарид
МАРкиназа i i iv i киназа митогенактивируемого белка
ii i
, i, i xi i
iii i ii , никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленная форма.
i i i
i
i i оптическая плотность
i i электрофорез в полиакриламидном геле
i фосфатносолевой буфер
полиэтиленгликоль
i К протеиназа К
фенилметилсульфонилфторид
Ртргеи ген прионового протеина млекопитающих
ген ген прионового протеина человека
РгР клеточная С изоформа прионового протеина
инфекционная скрепи изоформа прионового протеина прион
iv x i реакционноспособные кислородные радикалы РКР активные формы кислорода АФК
i соматическая
i додецилсульфат натрия
электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
1 xi i супероксид дисмутаза
,,,,ii
i а трансформирующий ростовой фактор.
ii i спонгиоформная энцефалопатия норок
i фактор некроза опухоли
v vi новый вариант
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Было предположено, что участок октапептидных повторов мог бы быть доменом, связывающимся с металлом, так как пептид имеет общую последовательность с протеином, богатым содержанием гистидина до iiii i , который, как считается, вовлечен в транспорт меди плазмы . Было предположено, что связывание меди к РгР может изменять конформацию домена октапептидного повтора, что может быть важно для нормальной функции РгР . В некоторых семьях, в которых наследственно передается , выявлено различное количество добавочных октапептидных повторов, вставленных в один аллель гена . V ii, . Нарушение вторичной структуры РгР у членов этих семей, например, через связывание меди или мисметаболизм меди, может иметь отношение к механизму формирования прионных болезней. Участки некоторых протеинов, например, коллагена, аналогичные региону октапептидных повторов РгР с высоким содержанием , , формируют свернутые спиралью, пружинообразные структуры. Делеции или точечные мутации в этом регионе коллагена вели к аутосомной доминантной болезни, вызванной дефектом остеогенеза II типа у людей, повидимому, через нарушение конформационной стабильности коллагена . Было предположено, что РгР играет роль в клеточной резистентности к оксидативному стрессу . Показано, что клетки мозжечка и коры головного мозга, неэкспрессирующие РгР РгР, более чувствительны к оксидативному стрессу и гибнут быстрее, чем клетки дикого типа. Этот эффект является обратимым в результате обработки клеток витамином Е. Выявлено, что i viv активность супероксид дисмутазы уменьшена у Ргпрмышей. Существенное повышение активности Мп супероксид дисмутазы у этих животных может компенсировать потерю ответа к оксидативно
му стрессу. Эти данные указывают на то, что РгР может влиять на активность супероксид дисмутазы и может играть важную роль в клеточной резистентности к оксидативному стрессу. В работе использованы первичные клетки коры головного мозга дневных эмбрионов мыши, клетки мозжечка 6дневных Ртр 0,0 мышей и мышей дикого типа . Клетки подвергали воздействию разной степени оксидативного стресса, индуцированного ксантин оксидазой в присутствии ксантина. Выживаемость Ргпрклеток коры головного мозга и мозжечка была одинаковой и они оказались более чувствительными к оксидативному стрессу, индуцированному ферментом, по сравнению с аналогичными клетками, полученными от мышей дикого типа. Однако, клеточная смерть была блокирована воздействием витамина Е, причем, наблюдали прямую зависимость, то есть, чем более высокие концентрации витамина Е применяли, тем больший процент выживших клеток получали. Более того, этот антиоксидант существенно повышал выживаемость РгРклеток по сравнению с клетками дикого типа. Эти результаты свидетельствуют о большей чувствительности РгРклеток к оксидативному стрессу. Клеточная смерть в культуре может происходить в результате действия других, отличных от кислородных радикалов, веществ. Ингибитор продукции оксида азота не изменял выживаемость РгР 1 клеток. Первые упоминания о скрепи относятся к 1В веку , . Инкубационный период, как правило, составлял года, хотя у многих инфицированных животных не отмечали развития болезни ii , . Оказалось, что разные породы овец обладали различной чувствительностью к прионам скрепи, инокулированным подкожно, что могло указывать на роль генотипа в резистентности животных к скрепи , . Решающий методологический успех в экспериментальном изучении скрепи был сделан , который сообщил об успешной трансмиссии скрепи мышам, что могло быть использовано для конечной титрации отдельных образцов. Этот подход обеспечил исследователей относительно дешевой моделью для проведения дальнейших экспериментов, которые способствовали изучению патогенеза этой загадочной болезни ii , ii, ii , ,. Выполенены эксперименты по изучению патогенеза скрепи, направленные на выяснение факторов, регулирующих длительность инкубационного периода скрепи и проявление нейропатологических изменений ii . Присутствие специфических клинических признаков, что служит основанием для подозрения на болезнь и постановки клинического дагноза.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.204, запросов: 145