Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами

Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами

Автор: Кузнецов, Андрей Вадимович

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 1999

Место защиты: Оболенск

Количество страниц: 243 с. ил.

Артикул: 238062

Автор: Кузнецов, Андрей Вадимович

Стоимость: 250 руб.

Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами  Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами 

1.1 Сведения по эмбриональному развитию подопытных животных.
III. 1.1 Кролик i.
III. 1.2 Вьюн i ii
III. 1.3 Черноморская мидия i viii .
1.2 Условия проведения экспериментов содержание и подготовка животных, получение сперматозоидов
III. 2.1 Опыты на i.
III. 2.2 Тестирование векторных свойств спермиев кролика с помощью
ооцитов золотистого хомячка.
1.2.3 Опыты на представителях разных систематических групп
1.3 Материалы и методы
II 1.3.1 Используемые в работе рекомбинантные конструкции.
II 1.3.2 Подготовка ДНК для трансформации спермиев и микроинъекции зигот
1.3.3 Эксперименты по связыванию сперматозоидами экзогенной ДНК
III. 3.4 Выявление бактериальной ргалактозидазы в ранних эмбрионах кролика
III. 3.5 Выделение хромосомной ДНК.
II 1.3.6 Проведение цепной полимеразной реакции
II 1.3.7 Дотгибридизация и Саузернблотинг
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
IV. 1 Предварительные эксперименты.
IV. 1.1 Опыты по инъекции экзогенной ДНК в зиготы
IV. 1.2 Попытка трансформации зрелых сперматозоидов кролика с использованием селективного маркера и селекции клеток по подвижности IV. 1.3 Изучение возможности использования везикулярного транспорта
для введения в спермии экзогенной ДНК
IV. 1.4 Исследование проницаемости мембран и деконденсации хроматина
сперматозоидов кролика
IV.2 Исследование процесса взаимодействия чужеродной ДНК со
сперматозоидами млекопитающих и факторов, влияющих на него
IV. 2.1 Изучение связывания радиоактивной ДНК сперматозоидами кролика 3 IV. 2.2 Факторы, влияющие на связывание экзогенной ДНК
сперматозоидами.
IV. 2.3 Связывание молекул ДНК сперматозоидами быка и человека
У.З Разработка метода инкорпорирования ДНК в спермии кролика.
IV. 3.1 Влияние диметилсульфоксида и кратковременного теплового
воздействия на подвижность сперматозоидов.
IV. 3.2 Ассоциация чужеродной ДНК со спермиями в присутствии
диме V.сульфоксида.
IV. 3.3 Влияние диметилсульфоксида на проницаемость сперматозоидов
для ДНК в присутствии семенной жидкости.
IV.3.4 Аддитивный эффект диметилсульфоксида и тепловой обработки на проницаемость сперматозоидов.
IV.4 Результаты переноса экзогенной ДНК сперматозоидами кролика в
яйцеклетки
IV. 4.1 Обнаружение чужеродной ДНК в ранних эмбрионах с помощью
полимеразной цепной реакции.
IV. 4.2 Идентификация репортерной ДНК по экспрессии гена в
доимплантационных эмбрионах.
IV. 4.3 Сравнение эффективности двух методик трансформации по
транзиентной экспрессии репортерного гена.
IV. 4.4 Воспроизводимость опытов по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами в ооциты. Отсутствие корреляции между подвижностью спермиев и экспрессией привнесенной ДНК в эмбрионах.
IV. 4.5 Обнаружение последовательности 3 в ДНК рожденных
животных
IV.5 Влияние трансформации спермиев кролика на их оплодотворяющую
способность, развитие эмбрионов и рождаемость потомства.
IV. 5.1 Развитие доимплантационных эмбрионов кролика после
искусственного осеменения трансформированными спермиями.
IV.5.2 Рождение потомства после искусственного осеменения трансформированными спермиями.
IV.6 Эксперименты по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами быка,
ЛЯГУШК1 ЛРПА, ВЬЮНА И МИДИИ
IV. 6.1 Манипуляции со спермиями быка
IV. 6.2 Опыты на травяной лягушке i.
IV. 6.3 Эксперименты со сперматозоидами карпа i i.
IV. 6.4 Опыты с вьюном i ii .
IV. 6.5 Эксперименты на черноморской мидии i viii .
V. ОБСУЖДЕНИЕ.
V.1 Использование сперматозоидов кролика в качестве переносчиков чужеродного генетического материала в ооциты
V. 1.1 Взаимодействие чужеродной ДНК со сперматозоидами. Диметилсульфоксидный шунт. Вариабельность состояния компетентности спермиев кролика к экзогенной ДНК
V.1.2 Обоснование выбора рекомбинантных конструкций и сроков визуализации экспрессии в опытах по переносу экзогенной ДНК в ооциты
кролика.
V.1.3 Перенос репортерной ДНК сперматозоидами в ооциты, транзиентная экспрессия гена и накопление ргалактозидазы в
доимплантационных эмбрионах.
V.1.4 Проникновение экзогенной ДНК в ядро спермия необходимое условие
ее интеграции в геном зиготы
V. 1.5 Возможные причины гибели доимплантационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток трансформированными сперматозоидами. К вопросу о существовании механизмов защиты от чужеродной ДНК у ранних эмбрионов
V.2 Пути повышения частоты интеграции и способы защиты привнесенной
СПЕРМИЕМ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК ОТ ДЕГРАДАЦИИ. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ
ПОДВИЖНЫХ ВЕКТОРОВ
V.2.1 Модификация сахарофосфатного остова и концов ДНК
V.2.2 Использование ферментов нуклеинового обмена и олигонуклеотидов
направленного действия
V.2.3 Применение адгезивных последовательностей элементов,. i
репликации и транспонирующих элементов в составе ДНК
V.2 4 Разработка систем селекции трансформированных эмбрионов
V.2.5 Использование элементов таргетинга генов
V.2.6 Применение ДНК разной конформации.
V.2.7 Перспективы использования подвижных векторов
VI. ВЫВОДЫ
VII. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
VIII. БЛАГОДАРНОСТИ.
IX. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БАВ биологически активное вещество БСА бычий сывороточный альбумин ГА глутаровый альдегид ДМСО диметилсульфоксид ДНКаза дезоксирибонуклеаза 1 ДТТ дитиотреитол ед единицы активности
кД килодальтон 1 дальтон равен 1,1x г
МЕ международные единицы МПБ мясопептонный бульон мРНК матричная РНК
одНК ДНК, обработанная ультразвуком озвученная ДНК
п.и. пара нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
СП сперматозоиды
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
трис гидроксиметиламинометан 2амино2гидроксиметил1,3пропандиол
ТХУ трихлоруксусная кислота
ТШ тепловой шок
УФ ультрафиолет
ФСБ фосфатносолевой буфер
ФСГ фолликулостимулирующий гормон
ХГ хорионический гонадотропин
чДНК чужеродная ДНК
ямДНК ДНК, связанная с ядерным матриксом рда ргалактозидаза
аРсЮТР 2дезоксицитидин5трифосфат, меченный в аположении фосфором Р
ЬвН ген гормона роста быка ЬвН гормон роста быка
среда БиггерсВиттенВиттингхема i, i, ii i,
ген хлорамфениколацетилтрансферазы хлорамфениколацетилтрансфераза i цитрат
V цитомегаловирус
хлорфеноловыйкрасныйрОгалактопиранозид
I 4,6диамидин2фенилиндолдигидрохлорид
2дезоксиаденозин5трифосфат
2дезоксицитидин5трифосфат
диэтиламиноэтил
2дезоксигуанозин5трифосфат
I дифференциальный интерференционный контраст
I дигоксигенин
дезоксинуклеотидтрифосфат
i 2дезокситимидин5трифосфат
этилендиаминтетрауксусная кислота
клетки эмбриональные зародышевые клетки
I твердофазный иммуноферментный анализ
клетки эмбриональные стволовые клетки
бромистый этидий
зеленый флуоресцирующий белок i
ген гуанинфосфотрансферазы
поверхностный антиген вируса гепатита В
гидроксиэтил1пиперазинэтансульфоновая кислота
IV. оплодотворение i vi i vi iii
ген ргалактозидазы
район, контролирующий локус i
длинный концевой повтор i
4метилумбиллиферилр0галактозид ацетат натрия нитроголубойтетразолиумхлорид фенилметилсульфонилфторид
I синтез с затравки i i i i i i
V вирус саркомы Рауса
комнатная температура
обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией v ii i
додецилсульфат натрия
x 3 I, 0,3 i 7,
x 3,6 I, 0,2 2 0, 7,
мечение концов ДНК с помощью терминальной трансферазы i i i
X 5бром4хлор3индолилр0галактопиранозид Хфосфат 5бром4хлор3индолилфосфат
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В некоторых работах приведены данные, касающиеся емкости сперматозоидов для чужеродной ДНК. Так, на примере спермиев морского ежа . ДНК было показано, что одним сперматозоидом связывается от до 4 молекул ДНК , . Для сперматозоидов мыши после мин инкубации эта величина составляла от 1, до молекул vi . ДНК . Результаты исследования емкости спермиев различных видов животных представлены ниже Таблица 2. Таблица 2. Связывание ДНК со спермиями обратимо. Эксперименты по конкурентному взаимодействию показали, что молекулы ДНК связываются сперматозоидами мыши с различной афинностью. Часть ДНК замещается легко, в то время как другая удаляется только при большом избытке конкурирующей ДНК кратное количество. Показано, что после 2, 3, 5 и отмывок, доля удержавшейся в бычьих сперматозоидах радиоактивной ДНК была соответственно 8,0, 7,5, 7,8 и 6,6 . В экспериментах по изучению кинетики связывания чужеродной ДНК зрелые сперматозоиды разных видов животных инкубировали в течение определенных промежутков времени с радиоактивной ДНК. Спермин тестированных видов демонстрировали сигмоидную , . ДНК. Сперматозоиды морского ежа . ДНК на протяжении мин , . Спермин млекопитающих ассоциировали часть чужеродной ДНК в течение первых мин vi . Процесс не зависел от температуры vi . В противоположность этому у сперматозоидов рыб взаимодействие происходило за сек . В некоторых работах зарегистрировано влияние температуры на связывание экзогенной ДНК спермиями птиц и млекопитающих . АРгС ,4 т. Р, к спермиям лягушки и мыши. Сперматозоиды помещали на фильтры, промывали и измеряли радиоактивность. В параллельных экспериментах после инкубации спермиев с ДНК клетки обрабатывали ДНКазой так, что оставалась только ДНК, проникшая в сперматозоиды. Кривые поглощения радиоактивной ДНК спермиями мыши и лягушки выходили на плато через мин инкубирования. В сперматозоиды мыши проникало добавленной ДНК, а в спермин лягушки . Зависимость связывания и поглощения ДНК сперматозоидами описывались кривыми Лэнгмюра. У сперматозоидов X через мин наблюдалось уменьшение связанной ДНК, вероятно, в результате разрушения клеток. Угоны Са2, 2 и ЭДТА оказывали незначительный эффект на поглощение ДНК. Пируват, глутамат и антимицин не оказывали влияния на проникновение ДНК. КТЗ при разных температурах 5 или С. Максимальное количество ДНК связывалось по прошествии мин инкубации. Ассоциация плазмиды со сперматозоидами протекала более интенсивно при высокой температуре. При С значительная доля сперматозоидов связывала линейную и кольцевую ДНК рКТЗ. После обработки суспензии клеток ДНКазой число сперматозоидов, содержащих чужеродную ДНК, уменьшалось. При температуре 5 С число спермиев, связавших ДНК, было меньше, чем при С. После добавления ДНКазы число спермиев, связавших кольцевую ДНК, также снижалось. Напротив, количество спермиев с линейной ДНК рКТЗ до и после обработки ДНКазой оставалось одинаковым, что указывает на ее возможное проникновение внутрь сперматозоидов. При помощи оптической и электронной микроскопии показано, что большинство радиоактивной ДНК взаимодействует с постакросомальной областью головки спермиев мыши, кролика и быка . ДНК со свиными сперматозоидами. Для визуализации мест связывания использовалась биотинилированная ДНК и комплекс стрелтавидинпероксидаза или стрептавидинфлуоресцеин. В обоих случаях сигналы были обнаружены на головке сперматозоида, но не на хвосте. Примечательно, что интенсивно были окрашены периферия головки и окружность ядра. Положительный сигнал зарегистрирован примерно у клеток. В отсутствие биотинилированной ДНК окрашивания не наблюдалось. Авторы высказали мнение, что использованные системы определения, вероятно, не способны показать, была ли ДНК поглощена головкой сперматозоида или связалась с поверхностью . Сперматозоиды быка тоже связывают чужеродную ДНК определенными областями. Они были обозначены i и соавт. IIV акросомальный участок I, экваториальный сегмент , постакросомальная область головки III и задняя часть головки IV. Большинство экзогенной ДНК связывалось с областью III.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.200, запросов: 145