Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы

Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы

Автор: Лягоскин, Иван Владимирович

Автор: Лягоскин, Иван Владимирович

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Покров

Количество страниц: 160 с. ил.

Артикул: 4625829

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
1. Введение
1.1 Актуальность темы
1.2 Цель и задачи исследований
1.3. Научная новизна работы
1.4 Практическая значимость результатов исследования
1.5 Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые
на защиту
1.6 Апробация и публикация результатов
1.7 Личный вклад автора в выполнении работы
1.8 Объем и структура диссертации
2. Обзор литературы
2.1 Общая характеристика микроорганизма и его таксономическое положение
2.2 Экология возбудителя сибирской язвы
2.3 Антигенный состав i i
2.3.1 Капсула
2.3.2 Клеточная стенка
2.3.3 Споры
2.3.4 Внеклеточные антигены В.i
2.4 Получение бактериальных антигенов
2.4.1 Физические методы
2.4.1.1 Продавливание с помощью пресса
2.4.1.2 Разрушение ультразвуком
2.4.1.3 Баллистическое разрушение
2.4.1.4 Измельчение в твердом состоянии
Оглавление
2.4.1.5 Получение термоантигенов
2.4.2 Химические методы
2.4.2.1 Экстракция антигенов клеточной поверхности
2.4.2.2 Применение детергентов
2.4.2.2.1 Ионные детергенты
2.4.2.2.2 Неионные детергенты
2.4.2.2.3 Соли желчных кислот
2.4.3 Физикохимические методы разрушения клеток
2.5 Индикация и идентификация возбудителя сибирской язвы в
объектах внешней среды
2.6 Заключение по обзору литературы
3. Собственные исследования
3.1 Материалы
3.1.1 Штаммы и изоляты микроорганизмов
3.1.2 Питательные среды
3.1.3 Белки и ферменты
3.1.4 Сыворотки
3.1.5 Антигены
3.1.6 Кислоты и основания
3.1.7 Хромогены и красители
3.1.8 Соли
3.1.9 Детергенты 5
3.1. Реактивы
3.1. Растворители
3.1. Хроматографические сорбенты и гелеобразующие среды
3.1. Растворы и буферы
3.1. Лабораторное оборудование
3.1. Животные
3.2 Методы
Оглавление
3.2.1 Получение спорового материала
3.2.2 Определение концентрации жизнеспособных спор
3.2.3 Изучение фенотипических свойств штаммов использованных
в работе
3.2.4 Изучение гемолитической активности
3.2.5 Приготовление антигенных препаратов
3.2.6 Получение специфических сывороток и их освобождение от группоспецифических антител
3.2.7 Концентрирование препаратов антигенов и иммуноглобулинов
3.2.8 Определение концентрации белка
3.2.9 Электронная микроскопия
3.2. Электрофоретический анализ препаратов и иммуноблоттинг
3.2. Выделение антител из полиспецифических сывороток
3.2. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена
3.2. Непрямой метод ТФ ИФА для скрининга антител при использовании растворимых антигенов
3.2. Прямой метод ТФ ИФА
3.2. Сэндвич метод ТФ ИФА для выявления антигена
3.2. Реакция диффузионной преципитации
3.2. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов иммуноглобулинов с ФИТЦ
3.2. Метод флюоресцирующих антител для выявления спор представителей рода i
3.2. Изготовление магноиммуносорбента
3.2. Статистическая обработка результатов
Оглавление
4. Результаты собственных исследований
4.1 Изучение биологических свойств штаммовизолятов группы В.

4.1.1 Сравнительная характеристика культурально
морфологических, биохимических и дифференциальных признаков штаммовизолятов группы В. используемых в
работе
4.1.2 Изучение антигенных свойств штаммовизолятов руппь В.
используемых в работе
4.2 Подбор методов выделения специфических антигенов из спор микроорганизмов рода i
4.3 Подбор эффективной схемы иммунизации животных для получения гипериммунных антиспоровых сывороток
4.4. Разработка непрямого метода твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антиспоровых антител
4.4.1 Оптимизация условий постановки ТФ ИФА с использованием растворимых антигенов спор В. i
4.4.2 Оптимизация условий постановки непрямого метода ТФ
ИФА с использованием спор В. i
4.5. Изучение антигенного состава спор исследуемых штаммов
4.5.1. Изучение антигенного состава спор штаммов В. i и
В. с использованием серологических реакций
4.5.2 Изучение полипептидных спектров спор исследуемых штаммов с использованием ПААГ электрофореза и иммуноблоттиига
4.5.3 Изучение специфической активности
противосибиреязвенных антиспоровых гипериммунных сывороток крови коз
Оглавление
4.6 Получение и характеристика видоспецифических противосибиреязвеиных антиспоровых антител
4.6.1 Освобождение антисиоровой сыворотки крови козы от группоспецифических антител
4.6.2 Выделение иммуноглобулинов из противосибиреязвеиной антиспоровой сыворотки крови козы
4.6.3 Изучение специфичности очищенных иммуноглобулинов
козы методом иммуноэлектронной микроскопии
4.6.4 Определение полипептидной специфичности очищенных иммуноглобулинов козы методом иммуноблоттинга
4.7 Конструирование препаратов для детекции антигенов В. аыкгасйу
4.7.1 Изготовление и изучение свойств противосибирсязвеиного антиспорового ФИТЦ конъюгата
4.7.2 Использование ТФ ИФА для детекции антигенов спор сибиреязвенного микроба
4.7.2.1 Оценка пригодности прямого метода ТФ ИФА для идентификации антигенов спор сибиреязвенного микроба
4.7.2.2 Разработка сэндвичметода ТФ ИФА для выявления антигена спор В. тиЬтсЬ
4.7.2.2.1 Определение сенсибилизирующей дозы иммуноглобулинов и рабочего разведения конъюгата
4.7.2.2.2 Определение оптимального времени взаимодействия компонентов реакции и температуры инкубации
4.7.2.2.3 Оценка чувствительности и специфичности сэндвич
метода Т Ф ИФА
4.8 Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения
Оглавление
возбудителя сибирской язвы 1 1
4.8.1 Подбор условий для конструирования и применения МИС
4.8.2 Оценка специфичнос ти изготовленного МИС
5. Обсуждение результатов
6. Выводы
7. Практические предложения
8. Список литературы
Приложения
Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
диаммониевая соль 2,2азинобис3этилбензтиазолин6сульфоновой кислоты АГ антиген
БСА бычий сывороточный альбумин
этилендиаминтетрааминоуксусная кислота
ЗФР забуференный физиологический раствор 7,,
КББ карбоиатбикарбонатный буфер 9,,
кДа килодальтон
ЛФ летальный фактор
магнитный сорбент
МИС магноиммуносорбент
МкАт моноклональные антитела
мкл микролитр
мкм микрометр
м.м. молекулярная масса
МФА метод флюоресцирующих антител
НАФ неполный адъювант Фрейнда
Не нормальная сыворотка
ОГ оптическая плотность
ОФ отечный фактор
ПААТ полиакриламидный гель
ПААГ полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия
ПА протективный антиген
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ПСС преципитирующая сибиреязвенная сыворотка
ПХ пероксидаза хрена
ПЭГ полиэтилен гликоль
Оглавление
РД реакция диффузионной преципитации
РТП реакция термопреципитации
РТПпозитивные РТП изоляты или штаммы микроорганизмов рода i положительно реагирующие в реакции термопреципитации по Асколи РТПнегативные Р1ТГ изоляты или штаммы микроорганизмов рода i отрицательно реагирующие в реакции термопреципитации по Асколи
Сэндвич сэндвич метод иммуноферментного анализа
СВК среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба СОПЭК среда для определения продукции экзотоксина и капсулообразования Се специфическая сыворотка
ТА термоантиген, растворимая фракция
Трис трисгидроксимстиламинометаи
ТФ ИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ТХУ трихлоруксусная кислота
УЗ ультразвуковой дезинтеграт спор
ФИТЦ флюоресцеинизотиоцианат
ФБР фосфатнобуферный раствор 7,,
ФБР Т ФБР, содержащий твин 7,,
ФБР Т БСА ФБР, содержащий твин и бычий сывороточный альбумин 7,,
ФВК фосфорновольфрамовая кислота
додецилсульфат натрия
фенилметилсульфонилфторид
метод с англ. аббр. полимеразная цепная реакция
обратный десятичный логарифм концентрации ионов НГ
Введение


Для преодоления указанных трудностей индикации патогенов из объектов окружающей среды был предложен метод, основанный на использовании магнитных сорбентов, представляющих собой полимерные микроранулы с композитными феррочастицами, и иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. Ефременко В. И., . Учитывая перспективность метода иммуномагнитной сепарации в последнее десятилетие учеными разрабатываются иммуномагнитные биосорбенты для экспресс индикации различных агентов. Так, Зинченко О. В. с соавт. Николаева О. Н., и др. И. Ефременко с соавт. МИС. Сибирская язва относится к инфекциям основным источником возбудителя которых в последние десятилетия стала почва. Однако до настоящего времени в арсенале практических врачей отсутствуют методы, позволяющие объективно оценить уровень зараженности мест сибиреязвенных захоронений и степень их эпидемической опасности. Применяемые утвержденные методы обнаружения . Ьургасов П. П. и др. Соркин Ю. И. и др. Г.Г. Онищенко и др. Использование селективных сред упрощает выделение В. Для повышения эффективности индикации В. Лбгарян А. Г. с соавт. По данным ряда авторов, клеточная стенка В. Безносов М. В. Микшис Н. И. и др, . Таким образом, проведение работ но совершенствованию методов индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды на основе конструирования магноиммуносорбента с иммобилизированными на его поверхности высокоспецифичными антителами против антигенных детерминант спор В. Целью данной работы являлось сравнительное изучение антигенного состава спор возбудителя сибирской язвы и близкородственных сапрофитов, получение видосиецифических противосибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов и конструирование на их основе магноиммуносорбентов, пригодных для селективного обнаружения спор В. Провести комплексное изучение фенотипических, антигенных и дифференциальных свойств штаммовизолятов группы В. Изучить полипептидный спектр поверхностных споровых белков сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов и подобрать эффективный метод выделения специфических антигенов из спор В. Подобрать эффективную схему иммунизации животных для получения иммунных сывороток с высокими титрами антиспоровьтх антител. Изучить полипептидную специфичность антител антиспоровых сывороток и перекрстную реактивность поверхностных антигенов спор штаммов группы i . В. i. Сконструировать магноиммуносорбент для обнаружения возбудителя сибирской язвы, изучить его селективные свойства, разработать методику применения и провести испытания в лабораторных и приближнных к реальным условиях. Определены методические приемы и их последовательность, дающие возможность конструировать магноиммуносорбент с иммобилизированными на его поверхности видоспецифичными сибиреязвенными антиспоровыми антителами. Разработан способ селективного выделения спор возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды. Установлено, что сэндвич метод ТФ ИФА на основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба позволяет дифференцировать споры В. В. агйИгат и оптимизирован метод выделения видоспецифических сибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов. На основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба изготовлены иммунореагенты для иммунофлюоресцентного и иммуиоферментного анализов и разработан высокоспецифичный сэндвич метод ТФ ИФА для детекции антигенов В. Ыкга5. Метод получения магноиммуиосорбента, обладающего селективной сорбцией спор сибиреязвенного микроба из пула спорообразующей микрофлоры предлагается к использованию при разработке и совершенствовании схем индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды. Методические рекомендации по подготовке проб почвы к исследованию на контаминацию возбудителем сибирской язвы г. Методические рекомендации по изготовлению и применению магноиммуиосорбента на основе иммуноглобулинов к спорам В. Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом, утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОСИ,БХОЗАКАДЕМИИ и рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН. Методические подходы к конструированию магноиммуиосорбента с иммобилизованными на поверхности антиспоровыми сибиреязвенными антителами и использование его для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.197, запросов: 145