Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных

Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных

Автор: Матвеева, Ирина Николаевна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2008

Место защиты: Щелково

Количество страниц: 275 с. ил.

Артикул: 4391435

Автор: Матвеева, Ирина Николаевна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Бешенство животных.
1.1.1. Сравнительная оценка методов диагностики
бешенства животных
1.1.2. Методы прямого обнаружения антигена вируса
бешенства
1.1.3. Методы выделения вируса бешенства.
1.1.4. Сравнительная оценка диагностической пригодности
1.2. Лабораторная диагностика лептоспироза. .
1.2.1. Краткая характеристика основных методов диагностики
1.2.2. Рестрикционный анализ как таксономический метод
1.2.3. ДНКДНК гибридизация в диагностике лептоспироза
1.3. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота
1.3.1. Введение.
1.3.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита КРС.
1.3.2.1. Традиционные методы диагностики инфекционного
ринотрахеита.
1.3.2.2. Иммуноферментный метод для диагностики
инфекционного ринотрахеита
1.3.2.3. Диагностика ОТТ с помощью гибридизации ДНК и
полимеразной цепной реакции
1.3.3. Диагностика вирусной диареиболезни слизистых
1.3.3.1. Общие положения в диагностике инфекции.
1.3.3.2. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной
диареиболезни слизистых оболочек ВДБС.
1.3.4. Лабораторная диагностика инфекции.
1.3.5. Лабораторная диагностика парагриппа3
1.3.5.1. Серодиагностика и ретроспективная диагностика
1.3.5.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа3.
1.3.6. Диагностика аденовирусной инфекции.
1.3.6.1. Серологическая идентификация.
1.3.6.2. Серодиагностика и ретроспективная диагностика
2. СОБСТВЕНН ЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.1.Штамм ы.
2.1.2.Инфекционность вируса.
2.1.3.Культуры клеток и среды.
2.1.4.Антитела и антигены
2.1.5.Сыворотк и
2.1.6.Выделение и очистка
2.1.7.Непрямой иммуноферментный анализ
2.1.8.Чувствительность и специфичность разработанной
тестсистемы ИФА л.
2.1.9.Молекулярное клонирование ДНК . рошопа.
2.1Статистическая обработка результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕНН ЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1.Усовершенствование технологии получения антирабической сыворотки для промышленного производства диагностических ФИТЦконыогатов.
3.2. Молекулярное клонирование ДНК .i серовара рошопа
для идентификации и дифференциации лептоспир.
3.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир.
3.2.2. Создание клонотеки ДНК . i серовара рошопа
3.2.3. Получение фрагментов ДНК . i серовара рошопа
3.2.4. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид.
3.2.5. Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНКДНК гибридизации.
3.2.6. Применение рекомбинантных плазмид для идентификации
и дифференциации лептоспир.
3.2.6.1. Применение плазмид , и для идентификации референтных штаммов лептоспир
3.2.6.2. Получение ДНКзондов для идентификации полевых изолятов и производственных штаммов лептоспир.
3.2.6.3. Определение специфичности ДНК . на коллекции штаммов различных видов микроорганизмов
3.2.6.4. Дифференциация производственных штаммов лептоспир
3.3. Разработка технологии получения компонентов комплексной
тестсистемы иммуиофермеитного анализа для выявления антител к
антигенам вирусов ИРТ, ПГ3, ВДБС, и АВ
.1. Промышленное культивирование клеток ПТ
3.3.2. Очистка и концентрирование вирусов и получение
антигенов для ИФА
3.3.2.1. Вирус парагриппа
3.3.2.1.1. Репродукция вируса парагриппаЗ, штамм ЗКСМ
3.3.2.1.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ3.
3.3.2.1.3. Получение антигена для иммуноферментного анализа
ПГЗКРС.
3.3.2.1.4. Изучение белков вируса ПГ3 из вируссодержащих суспензий
3.3.2.2. Получение аденовирусных антигенов для ИФА.
3.3.2.3. вирус
3.3.2.3.1. Репродукция вируса, штамм .
3.3.2.3.2. Очистка и концентрирование вируса
3.3.2.4.Вирус ИРТ.
3.3.2.4.1. Репродукция вируса ИРТ КРС
3.3.2.4.2. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС.
3.3.2.5. Вирусная диареяболезнь слизистых
3.3.2.5.1.Очистка и концентрирование ВДБС.
3.3.3. Культивирование . и очистка протеина А.
3.3.4. Выделение иммуноглобулина класса из сыворотки крови
3.3.5. Получение анти КРС гипериммунной сыворотки.
3.3.6. Выделение антивидовых иммуноглобулинов анти КРС
3.3.7. Мечение антивидовых иммуноглобулинов анти КРС ферментом пероксидазой из хрена
3.3.8. Получение специфических к вирусам ИРТ, ПГ3,ВДБС, ,
АВ и отрицательной референс сывороток КРС.
3.3.8.1. Получение специфических к вирусам сывороток крови
3.3.8.2. Получение отрицательной референссыворотки крови
3.3.9. Постановка, учет и критерий оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ3, ВДБС, и АВ.
3.3.9.1. Оптимизация условий постановки комплексной иммуноферментной тестсистем
3.3.9.2. Определение рабочего разведения сывороток
3.3.9.3. Определение оптической плотности ОП0 контрольных
сывороток
3.3.9.4. Определение критериев оценки результатов ИФА.
3.3 Контроль воспроизводимости результатов определения антител комплексной тестсистемой ИФА
3.3 Оценка эффективности иммуноферментной тестсистемы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ3, ВДБС, и
АВ в сравнении с методами аналогичной направленности
3.3 Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ГТГ3, ВДБС, РС и АВ в комплексной тестсистеме ИФА.
3.3 Применение комплексной иммуноферментной тестсистемы
для серологического мониторинга респираторных болезней КРС.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АВ аденовирус
БП биологическая проба
ВДБС вирусная диарея болезнь слизистых
Д дальтон
кД килодальтон
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗФР забуференный физиологический раствор
ИРТ инфекционный ринотрахеит
ИФА иммуноферментный анализ
ИЭФ иммуноэлектрофорез
МА моноклональные антитела
международные единицы
ММ молекулярная масса
МФАметод флюоресцирующих антител
о.е. оптические единицы
1 оптическая плотность
ОП0 оптическая плотность при 0 нм
ОФД ортофенилендиамин
КРС крупный рогатый скот
рекомбинантная плазмида
ПААТ полиакриламидный гель
ПГ3 парагрипп
ПТ перевиваемая линия клеток почки теленка
ПЭГ полиэтилен гликоль
ПЦР полимеразная цепная реакция
реакция нейтрализации
респираторносинцитиальный вирус
РДП реакция диффузионной преципитации
РНГА реакция непрямой гсмагглютииации
РСК реакция связывания комплемента
РТГА реакция торможения гемагглютинации
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
ТФИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ТЦД тканевая цитопатическая доза
ФБР фосфатный буферный раствор
ФИТЦ флуоресциина изотиоционат
I иммуноглобулин
иммуноглобулин класса
сефароза бромциансефароза
. i
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Так, с помощью набора антинуклеокапсидных МА было показано, что исследуемые родственных вирусу бешенства изолята относятся к серотипам, при этом два серотипа, полученные от европейских летучих мышей, четко отличались от предыдущих серотипов V С. Вышеописанное невозможно без использования МА, однако для диагностики бешенства в лабораториях наибольшее распространение получили наборы препаратов на основе поликлональных антител, поскольку данные антитела позволяют выявлять не только уникальные эпитопы, но и общие антигенные детерминанты, антигенов вируса бешенства, тем самым повышая результативность реакции. Важным критерием эффективности применения методов являетсяполучение высокоактивных, специфических антител. С этой целыо Недосековым ВВ. Кроме этого, для повышения экспрессности используемого метода были оптимизированы условия постановки реакции за счет уменьшения времени инкубирования реагентов. В итоге, при использовании ТФИФА диагноз на бешенство может быть поставлен в течение 2 часов. НедосековВ. Биологическая проба Метод биологической пробы БП на мышах является одним из основных при постановки диагноза уже более лет и зарекомендовал себя как наиболее чувствительный референстест. Результат биопробы, как положительный, так и отрицательный, должен быть подтвержден МФА у павших мышей или убитых во время агонии. Так, кроме необходимости применения большого количества животных, для проведения теста необходимо продолжительное время анализа инкубационный период при заражении уличным вирусом бешенства варьирует от 7 до дней, для некоторых изолятов до 2 мес. Также необходимо отметить особые условия для выполнения БП, значительные экономические затраты. С целью повышения результативности биопробы Недосековым с соавт. ДЭАЭдекстран, преднизолон, гидрокортизон для увеличения результативности метода. Таким образом, несмотря на указанные недостатки метод БГ1 является самым чувствительным тестом и обязательным методом при исследовании патологического материала на бешенство М. Выделение и идентификация вируса бешенства в культуре клеток. Для этой цели используются различные клеточные системы. Так, i М. ВНК, клон , мышиной нейробластомы С, клон и фибросаркомы собаки А. Проведенные исследования показали высокую чувствительность культуры клеток ВПК, которая позволяет в течение часов проводить изолирование и титрование уличных штаммов вируса бешенства. Тем не менее, общепризнанно, что клетки мышиной нейробластомы С наиболее чувствительны к заражению и не требуют адаптации уличных изолятов вируса бешенства по сравнению с другими испытанными клеточными линиями. Кроме этого, заражение глиальнык клеток нейробластомы мыши С и клеток НГУК невринома гасссрова узла крысы также позволяют получать положительный ответ через часов 6,5, 8. В исследованиях Недосекова В. В. с соавт. НГУК1 и . Оптимальные результаты были получены при использовании , которая позволила выделить вирус и поставить диагноз в течение часов с детекцией репродуцирующегося вируса по фокусам флюоресценции Недосеков В. В., . Кроме данных клеточных систем возможно применение клеток , в которых вирус бешенства вызывает цитопатическое действие уже через час без дополнительной адаптации С. Таким образом, использование методики изоляции вируса бешенства в культуре клеток существенно сокращает время для выделения вируса и постановки диагноза от до 2 дней кроме этого, устраняется необходимость в экспериментальных животных и значительно уменьшается стоимость исследований 7, ,8. К сожалению, данная методика не может применяться в каждой лаборатории необходимы навыки работы с культурой клеток, постоянное поддержание культуры, хотя для многих лабораторий это не проблема. Для проведения сравнительных исследований традиционными методами было тестировано 0 полевых изолятов в результате получено полное соответствие 0 МФА, выделения вируса методом биопробы и ТФИФА . Такие же результаты получены при исследовании патологического материала, фиксированного в жидкости Карнуа К. С аналогичной целью Недосековым В. В. с соавт. По результатам исследования 0 положительных проб мозга животных чувствительность РПИФ составила , в то время как обнаружение телец БабешаНегри и результативность РДП составили 5 и соответственно.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.199, запросов: 145