Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы

Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы

Автор: Гудков, Денис Андреевич

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 160 с. ил.

Артикул: 4328565

Автор: Гудков, Денис Андреевич

Стоимость: 250 руб.

Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы  Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Фермент органофосфатгидролаза.
1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента
1.1.2. Пространственная структура ОРН.
1.2. Создание гибридных белков.
1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках.
1.2.2. Флуоресцентные белки.
1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок
1.2.2.2. чувствительные генетически модифицированные аналоги
1.2.3. ОРН в составе гибридных белков.
1.3. Рефолдинг белков из телец включения.
1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга.
1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков
1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток . i для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков.
1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме.
1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полу периодическом режиме
1.4.3. Аэрация среды, использование псрфторуглсродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования
1.4.4. Экспрессия генноинженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов.
1.5. Применение растворимой формы фермента i
1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОВ.
1.5.2. Фнльтрующесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и приборы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Ферменты.
2.1.3. Бактериальные штаммы.
2.1.4. Питательные среды
2.1.5. Составы растворов
2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды
2.1.7. Приборы
2.2. Методы
2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН
2.2.2. Определение оптимума действия фермента
2.2.3. Исследование термостабильности.
2.2.4. Приготовление компетентных клеток . i
2.2.5. Трансформация компетентных клеток . i
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток . i.
2.2.7. Рестрикция ДНК и выделения фрагментов электрофорезом в агарозном геле.
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.9. Конструирование плазмид i5 и i5.
2.2 Определение уровня экспрессии генноинженерных конструкций i, и i5 и органофосфатгидролазной активности гибридных белков. Изучение кинетики роста клеток . i 5
2.2 Определение растворимости белка.
2.2 Выделение и очистка иолигистидинсодержащих белков с использованием металлхелатиру ющих носителей.
2.2 Подготовка криоПААГ носителей
2.2 Очистка белка i.
2.2 Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле ДСНэлектрофорез
2.2 Исследование флуоресцентных свойств гибридных белков
2.2 Компьютерное моделирование
2.2 Наработка препарата фермента i для его применения в экспериментах прикладного характера
2.2 Приготовление фильтрующесорбирующего самодегазирующсгося материала
2.2 Дезактивация РМ, полученных в результате химического гидролиза вещества типа Vx с применением рецептуры РДГД с использованием препарата фермента i
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН.
3.1.1. Выбор межмолекулярных спенсеров.
3.1.2. Создание генноинженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков i5 и i5.
3.1.3. Экспрессия полученных генноинженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков i5 и i
3.1.4. Выделение и очистка новых гибридных белков
3.1.5. Физикохимические и каталитические характеристики генстическимодифицированных аналогов ОРН
3.1.6. Исследования структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования
3.1.6.1. Моделирование структуры димера ОРН.
3.1.6.2. Моделирование структуры мономера ОРН.
3.1.7. Исследование термостабильности белка i5.
3.1.8. Исследование флуоресцентных свойств полученных гибридных белков
3.2. Рефолдинг гексагнстидинсодержащей органофосфатгидролазы
3.2.1. Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения процесса
3.2.2. Проведение рефолдинга i на металлхелатирующем носителе
3.2.3. Активация фермента после рефолдинга
3.3. Оптимизация условий культивирования клеток . i , трансформированных генноинженерной конструкцией i, для увеличения выхода растворимой формы фермента i.
3.3.1. Влияние времени введения индуктора в среду культивирования клеток Я i , трансформированных генноинженерной конструкцией i, на их удельную органофосфатгидролазную активность
3.3.2. Влияние температуры культивирования на выход удельной органофосфатгидролазной активности в клетках . i , трансформированных генноинженерной конструкцией i.
3.3.3. Культивирование клеток . i , трансформированных генноинженерной конструкцией i, в периодическом режиме с внесением подпиток.
3.3.4. Влияние перфторуглеводородов на выход активной биомассы клеток . i , трансформированных генноинженерной конструкцией i
3.4. Применение ферментного препарата
3.4.1. Исследование процесса разрушения клеток . i продуцентов i ультразвуком
3.4.2. Длительное хранение ферментною препарата i в различных условиях
3.4.3. Фильтрующссорбирующий самодегазирующийся материал, содержащий i6, для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС
3.4.3.1. Разработка самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС
3.4.3.2. Испытание самодегазирующегося материала для использования в индивидуапьных средствах химзащиты от воздействия ФОС
3.4.4. Детоксикация реакционных масс, полученных в результате химического гидролиза ФОБ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Исследуя возможность протонирования активного центра ОРН, авторы моделировали присоединение протона к мостиковому гидроксидиону или аминокислотному остатку Азрзоь Было показано, что структура активного центра фермента, образованная ионами и молекулой воды, в результате оптимизации с помощью квантовохимических методов переходит в структуру, образованную протонированным остатком Афзоь При использовании в качестве исходной структуры комплекс ИОНОВ С С МОСТИКОВЫМ ГИДрОКСИДИОНОМ И протонированным остатком АбРзо было показано, что оптимизированный таким образом активный центр фермента находится в строгом соответствии с данными, полученными в результате проведения рентгеноструктурного анализа. Принимая во внимание тот факт, что кристаллы ОРН для рентгеноструктурного анализа были получены при 9,0 , а также то, что рКа для реакции Сс НгО СсЮН составляет 7,6 , можно предположить, что в данном случае мостиковым лигандом являлся гидроксидион. Следует отмстить, что при формировании активного центра фермента происходит перераспределение электронной плотности между ионом металла и лигандами, в результате чего могут изменяться эффективные заряды элементов, участников процесса комплексообразования. При варьировании эффективного заряда иона П в составе активного центра фермента ОРН методами квантовой механики и молекулярной динамики было показано, конфигурация активного центра фермента наиболее точно соответствует экспериментальным данным при эффективном заряде на ионах металла 1,5 . В составе активного центра ОР могут находиться различные ионы металлов. Роль ионов металла, находящихся в а и 3 положениях, в механизме гидролиза ФОС различна. Согласно современному представлению о механизме действия фермента, существует взаимодействие обоих ионов металла друг с другом в каталитическом акте . В реакции гидролиза ФОС аион участвует в процессе активации молекулы воды, необходимой для осуществления нуклеофильной атаки фосфорного центра субстрата, второй отвечает за поляризацию связи Р0 в субстрате при образовании ферментсубстратного комплекса. Сравнения ЭПРспектров кристаллов ОРН, кристаллов комплексов ОРН с ингибиторами диизопропилметилфосфонагом и триэтилфосфатом, а также кристаллов комплексов ОРН с продуктом гидролиза ФОС диэтилфосфатом, все кристаллы получены при 8,0, подтвердили данное предположение . Важные особенности механизма протекания процесса гидролиза параоксона и зарина, катализируемого ферментом ОРН, были выявлены с помощью молекулярного моделирования соответствующих ферментсубсгратных комплексов . Показано, что на начальном этапе реакции образуется прочная координационная связь между кислородом Р0 субстрата и ионом 2 активного центра фермента. Результаты были подтверждены рентгеноструктурными данными, полученными для комплексов фермента с негидролизуемыми аналогами субстратов , , а также квантовохимическими исследованиями механизма реакции гидролиза параоксона и других субстратов . Сделано предположение, что гидрофобный остаток Тгрзо9 предназначен для ограничения доступа молекул растворителя к активному центру. Установлено, что реакция гидролиза ФОС, катализируемая ОРИ, протекает по 8ы2механизму с инверсией конфигурации атома фосфора , , . Схема механизма гидролиза параоксона ферментом ОРИ 2, модифицированная согласно современным литературным данным, представлена на рис. Рис. Модель механизма действия фермента I I. Помимо функциональных групп фермента, принимающих непосредственное участие в катализе, в структуре белковой глобулы присутствуют гидрофобные участки, влияющие на связывание субстрата и определяющие, таким образом, специфичность фермента. На основании рентгеноструктурных исследований кристалла ферментсубстратного комплекса ОРН с нсгидролизусмым аналогом параоксона диэтил4метилфелнилфосфонатом была построена модель связывающего субстрат домена ОРН , . Уходящая группа нсгидролизуемого аналога параоксона располагается в полости, образуемой остатками i7 1, РЬезоб и 3i7 карман I рис. Одна из этоксигрупи взаимодействует с группой, образованной Тгрз, Псюб, Iеизоз РЬезоб, i, карман К2, другая с областью, содержащей Тгрз, РЬепг, i, РЬезоб и Тугзо9 карман КЗ.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.184, запросов: 145