Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов

Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов

Автор: Богданенко, Елена Валентиновна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 227 с. ил.

Артикул: 3012057

Автор: Богданенко, Елена Валентиновна

Стоимость: 250 руб.

Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов  Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов 

Оглавление.
Список сокращений
Общая характеристика работы .
1. Обзор литературы. Невирусный перенос генов в
экспериментальной генотерапии.
1.1. Введение.
1.2. Перенос ДНК в голом виде.
1.3. Типы векторов, их достоинства и недостатки.
1.4. Механизм генного переноса.
1.5. Доставка генетических конструкций в ядро.
1.6. Применение в опытах и в практике различных невирусных
систем.
1.6.1. Характеристика катионных липосом и их комплексов с ДНК.
1.6.2. Основные закономерности при использовании
геносом i viv.
1.6.3. Хитозаны и их взаимодействие с мембранами.
1.6.4. Полиамииы.
1.6.5. Аминокислоты и белки.
1.6.6. Анионные чувствительные полимеры.
1.6.7. Полиэтиленгликоль и циклодекстрины.
1.6.8. Полиэтиленимины.
1.6.9. Полиуретан.
1.6 Полипропиленимииы.
1.6 Наносферы.
1.6 Конъюгаты.
1.6 Магиитолипосомы.
1.7. Введение геносом людям.
1.8. Заключение.
2. Материалы и методы исследования.
2.1. Гидрофобные олигокатионы МОНО, ДИ и
ТРИХОЛЕНИМI, II и III.
2.2.Модифицированный лактозолипид.
2.3. Катионные липиды КЛИП, КЛИП 1, КЛИП 6 и гликокатионный липид ГЛИКОКЛИП.
2.4. Дикатионные липиды ДЕГА.
2.5. Глицирризин, атокофероловый эфир янтарной
кислоты и рНчувствительные липосомы.
2.6. Липосомы.
2.7. Изучение сродства липосом к клеткам.
2.8. Получение тотальной Смеченой общей ДНК из эукариотических клеток, растущих в культуре.
2.9. Получение Саденозин меченой ДНК.
2 Маркерные генетические конструкции.
. Получение плазмидной ДНК.
. Очистка плазмидной ДНК с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ.
. Электрофорез ДНК.
2 Приготовление геносом с Смеченой и плазмидной ДНК.
2 Физикохимические методы исследования.
. УФспектры плавления ДНК.
. Электронная микроскопия.
. Исследование спектров люминесценции пирена в растворах ДНК при формировании комплексов ДНК олигокатион.
2 Культуры трансформированных эукариотических клеток.
2 Исследование влияния возможных переносчиков генов
и ДНК на компоненты системы комплемента.
.Тестирование антикомилементарной активности.
2 Влияние липидов и липосом на рост клеток и на синтез ДНК в культуре клеток.
. Препараты ХОЛЕНИМ.
. Препараты КЛИП и ГЛИКОКЛИП.
2 Определение активности репортерного гена в трансфицированных клеточных культурах.
. рСМУБРОШ РОа1.
. Плазмидная ДНК с геном люциферазы светлячков рСМУЕис.
. Тестирование экспрессии гена зеленого флюоресцентного белка рЕСЕРЫ 1
2 Трансфекция с использованием преципитата фосфата кальция ДНК.
2 Культивирование клеток с рНчувствительными липосомами
2 Животные.
2 Введение геносом в воротную вену и почечную артерию.
. Анестезия авертином.
.В ведение в воротную вену печени.
.Введение липоплексов в почечную артерию.
.Введение геносом внутрибрюшинно.
2 Изучение биораспределения геносом ХОЛЕНИМ в организме мышей с помощью ,чСтимидинмеченой ДНК.
2Введение комплексов с лактозолипидом и Ргалактозидазным геном.
2 Тестирование активности чужеродного гена в органах экспериментальных животных.
. Спектрофотометрическое определение.
. Г истохимия.
2 Статистическая обработка числовых данных и графическое
представление.
2 Методика проведения эксперимента по включению радиоактивной метки в липиды и ее выведению из клеток.
2 Определение фракций липидов в тимусах.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
3. Физикохимические свойства комплексов ХОЛЕНИМ
с препаратами геномной ДНК.
3.1. Спектрофлуориметрия и критическая
концентрация мицеллообразования.
3.2. Влияние на плавление ДНК.
3.3. Размеры и форма геносом.
3.4. Спектры кругового дихроизма КД.
3.5. Результаты изучение сродства липосом к клеткам.
4.Проведение экспериментов на клеточных линиях.
Безопасность липидных медиаторов и эффективность трансфекции
4.1. Влияние препаратов липосом и ХОЛЕНИМ на рост линий эукариотических клеток и на синтез ДНК в клетках.
Исследование цитотоксичности и генотоксичности
4.2. Потенциальная цито и генотоксичность ГЛИКОКЛИПа, липосом
Г ЛИКОК ЛИПБОРЕ и КЛИПФХ, лактозилированного диглицерида
4.3. Обсуждение возможности переноса генов с помощью катионных липидов КЛИП1 и КЛИП6 и рНчувствительных
липосом.
4.4. Трансфицирование культур эукариотических клеток новыми невирусными системами
4.4.1. Перенос функционального гена в клетки РС с помощью
препаратов ХОЛЕНИМ.
4.4.2. Перенос функциональных генов в клетки эукариот с помощью лилосом, содержащих препараты ХОЛЕНИМ
и липидыпомощники.
4.4.3. Перенос функциональных генов в культуры эукариотических клеток с помощью рНчувствительных липосом и катионных липидов КЛИП1 и КЛИП6.
4.4.4. Перенос и экспрессия генов с помощью нового катионного гликолипида Г ЛИКОК ЛИП и гликолипоплекса
4.4.5. Перенос гена посредством липосом с ДЕГА.
5. Перенос ДНК i viv и влияние липоплексов на иммунную систему животных
5.1. Влияние новых липидных медиаторов на иммунную систему.
5.2. Биораспределение геносом ХОЛЕНИМ, содержащих 4Стимидин меченую ДНК, в организме экспериментальных мышей.
5.2.1. Внутрибрюшинное введение.
5.2.2. Введение комплексов ХОЛЕНИМов с СДНК в воротную вену печени.
5.2.3. Введение комплексов ХОЛЕНИМов с ,4СДНК в почечную артерию.
5.2.4. Перенос Стимидип меченой ДНК с помощью амфифильных липосом.
5.3. Генный перенос i viv с помощью лактозилированных
липосом при введении комплексов в воро тную вену печени.
5.4. Биораспределение ,4Саденозин меченой ДНК.
5.5. Генный перенос i viv плазмиды V с помощью ХОЛЕНИМов.
5.6. Гистохимическое исследование экспрессии гена бактериальной ргалактозидазы в тканях и клетках мышей при трансфекци i viv
липосомами на основе ХОЛЕНИМОВ и лактозилированных липосом.
5.7. Регистрация биораспределения плазмидной ДНК спектрофотометрически.
6. Исследование скорости обмена липидов в клетках эукариот.
Заключение
Выводы
Список литературы


Хорошая проницаемость через мембраны и нетоксичность позволяют новым липидным системам в комбинации с липидамипомощниками обеспечить эффективность трансфекции генов галактозидазы ХОЛЕНИМы, люциферазы ГЛИКОКЛИП и зеленого флуоресцентного белка ДЕГА3 i vi на уровне коммерческих препаратов, а в ряде случаев и выше. ХОЛЕНИМ эффективность зависит от соотношения гиброфобностьгидрофильность чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции. Липидные векторы с адресными углеводными группами, в частности, ГЛИКОКЛИП, позволяют добиться более высокого уровня экспрессии белка, чем при использовании негликозилированного липида КЛИП. Новые липидные векторы при введении их животным в дозах до 0 мг на мышь не вызывают токсических явлений в виде видимых повреждений органов и ухудшения состояния животных. Они способны незначительно активировать систему комплемента, однако именно это явление может быть одной из причин адресной доставки комплексов с радиоактивной ДНК в выделительные органы наряду со способом введения, соотношением липидДНК и химической структурой липида. Изучение трансфекционной способности новых векторов i viv с применением не только гистохимии, но и спектрофотометрии, позволяет увеличить эффективность поиска и отбора самых эффективных переносчиков генов в целях генотералии. Наиболее эффективными из исследованных нами являются препараты ХОЛЕНИМ и лакгозолипид в виде липосом с фосфатидилхолином и холестерином. Основное содержание работы отражено в научных публикациях из которых 3 в центральной, 4 в иностранной печати и в материалах международных и отечественных конференций и симпозиумов. Список публикаций приводится в конце автореферата. Работа изложена на русском языке, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 3 наименования работ отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 7 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 6 таблицами и рисунками. Введение. Генетическая коррекция и модификация генома соматических клеток организма представляют собой огромный интерес для ряда областей как теоретической, так и прикладной биологии и медицины. Трансгенез особенно актуален при создании сх культур и животныхпродуцентов с новыми, заранее заданными свойствами. Эта операция, основанная на внедрении генноинженерной конструкции в участок хромосомной ДНК, может приводить к существенному изменению работы собственных генов и целых участков генома организма т. Однако вследствие неспецифической интеграции генноинженерной конструкции может происходить разрушение структурной части гена кодирующей области, цистрона, ведущее к существенным нарушениям метаболизма и, как следствие, к появлению нежизнеспособных организмов. В отличие от устойчивой генетической трансформации, или трансгенеза, временная генетическая коррекция представляет собой такое изменение метаболизма в клетке, при котором происходит модуляция экспрессии собственных генов или временная экспрессия введенных извне генетических конструкций. В настоящее время экспериментальная генная терапия бурно развивается, и не запутаться во все вновь появляющихся публикациях очень сложно. В данном обзоре нами предпринята попытка классифицировать основные направления и наработки в этой отрасли, в которой сплелись биохимия, физиология, молекулярная биология, иммунология и даже физика. Перенос ДНК в голом виде. Возможен перенос ДНК в клетки двумя способами в голом виде или в комплексе с элементами вируса или веществамипереносчиками синтетического происхождения. Для переноса голой ДНК предлагается использовать метод электропорации, при этом идет поиск оптимальных условий длины и частоты импульса, концентрации ДНК. Так, при использовании длинных электрических импульсов низкой амплитуды на четырех гистологически различных моделях опухолей мышиной меланомы В, крысиной карциносаркомы Р, мышиной саркомы и карцинома мочевого пузыря человека Т была достигнута трансфекция плазмидой, несущей ген , на прикрепленных клетках, суспензии клеток и твердых опухолях . Перенос гена интерлейкина I в составе голой плазмиды в мышцу посредством электропорации i viv оказался эффективным средством лечения крыс с аутоиммунным миокардитом .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.260, запросов: 145