Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae

Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae

Автор: Фоминов, Глеб Вадимович

Автор: Фоминов, Глеб Вадимович

Шифр специальности: 03.00.15

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 147 с. ил.

Артикул: 2870519

Стоимость: 250 руб.

1. Введение структура и функции клеточной стенки
2. Синтез глюканов клеточной стенки.
2.1. Синтез Р1,3глюканов клеточной стенки.
2.1.1. р1,3глюкансинтетаза.
2.1.2. Ген НКЯ
2.1.3. Семейство генов, родственных .
2.1.4. Семейство генов, родственных 1ЮЬ2.
2.2. Синтез р1,6глюканов
2.2.1. Ген ККЕ
2.2.2. Ген ВЮ1.
2.2.3. С1ШЮЬй1, ЯОТ2ЮЬ и некоторые другие гены, кодирующие
белки, участвующие в синтезе связанных гликанов и сворачивании
секретирусмых белков.
2.2.4. Гомологичные гены КЯЕ6 и ЖЛГ.
2.2.5. Ген КЯЕТШ5.
2.2.6. Ген КЯЕ
2.2.7. Гены КЯЕ9 и КШ1.
3. Синтез хитина клеточной стенки
3.1. Хитинсинтетаза 1.
3.2. Хитинсинтетаза II
3.3. Хитинсинтетаза Ш.
4. Синтез связанных гликанов сскретируемых белков.
4.1. Формирование коровой части.
4.2. Реакции, протекающие в комплексе Гольджи формирование внешних цепей или зрелого кора.
5. Синтез Освязанных гликанов секретируемых белков
6. Формирование гликозилфосфатидилинозитиого I якоря.
6.1. Структура I якоря
6.2. Формирование I якоря и его присоединение к белку.
6.3. События, следующие за присоединением I якоря к белку.
6.3.1. Деацнлирование I
6.3.2. Модификация липидной составляющей I якоря.
6.3.3. Добавление пятого остатка маинозы.
6.3.4. Встраивание некоторых белков, несших I якорь, в КС
7. Сворачивание секретируемых белков.
7.1. Связанная с ЭР деградация неправильно свернутых белков , i i i i.
7.2. Ответ клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков , i
7.3. Роль ионов кальция в сворачивании секретируемых белков
8. Заключение, постановка задач исследования.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Материалы и методы
1.1. Штаммы, среды, условия культивирования и стандартные генетические методы
1.2. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией 2.
1.3. Плазмиды и генноинженерные манипуляции.
1.4. Флюоресцентная микроскопия
1.4.1. Окрашивание вакуолей в клетках дрожжей.
1.4.2. Окрашивание ДНК клеток дрожжей с помощью
1.4.3 Флюоресценция химерных белков, содержащих в своем составе
1.4.4 Окрашивание хитина клеточных стенок дрожжей калькофлюором белым.
1.5. Измерение активности ргалактозидазы в лизатах клеток дрожжей.
2. Результаты исследования
2.1. Клонирование и ссквенирование мутантной аллели
2.2. Гены, мутации в которых летальны или полулегальны в комбинации с мутацией .
2.2.1. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией .
2.2.2. Клонирование генов дикого типа, соответствующих мутантным аллелям и 2.
2.2.3. Локализация белка
2.3. Чувствительность мутанта к кофеину
2.3.1. Чувствительность к кофеину у разных мутантов4.
2.3.2. Морфология вакуолей в клетках мутанта
2.3.3. Чувствительность к кофеину мутанта не связана с подавлением активности фосфодиэстераз, гидролизующих сАМР, и ослаблением КС.
2.3.4. Клонирование генов, способных в мультикопийном состоянии подавлять чувствительность мутанта 2 к кофеину
2.3.5. Способность некоторых клонированных генов супрессировать другие фенотипические проявления мутации .
2.3.6. Влияние мутации на уровень экспрессии гена I4.
3. Обсуждение результатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФаза адснозинтрнфосфатаза ГТФаза гуанозинтрифосфатаза КС клеточная стенка ОРС открытая рамка считывания ПЦР полимеразная цепная реакция ЭР эндоплазматический ретикулум
2x x i, среда для выращивания бактерий аденозин5трифосфат с циклический аденозинмонофосфат
ii i, белок, связывающийся с промоторным элементом, активируемым сАМР I 4,6iii2i ii, 4,6диамидино2фенилиидолдигидрохлорид, краситель, окрашивающий ДНК долихилфосфатманноза iii, 1,4дитиотреитол
i, усовершенствованный зеленый флюоресцирующий белок ixiii i, этилендиоксн диэтнлсндинитрилотетрауксусная кислота i i i i i, ассоциированная с ЭР деградация белков
4 3ii4iixi iii ii, дибромид ДГ3триэтиламмониумпропил4рдиэтиламинофенилгексатриеннл пиридиниум вакуолярный краситель
гуанозин5дифосфат
I глюкозаминилфосфатидилинозит
I ацетилглюкозаминилфосфатидилинозит
I iii, гликозилфосфатидилинозит
гуанозин5трифосфат
сигнальный путь ii iiv i i ,
каскад иротеинкиназ, участвующий в ответе клетки на повышение осмотического давления среды среда ii для выращивания бактерий i, стандартный фосфатнобуферный раствор i ii i, синтетическая минимальная среда с глюкозой для выращивания дрожжей i , додсцилсульфат натрия способность колоний образовывать белые секторы
неспособность или ослабленная способность колоний образовывать белые секторы i i 2, Са2АТФазы саркоэндоп лазматического рети кулума уридии5дифосфат
i , ответ клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков
x x, полная среда с глюкозой для выращивания дрожжей среда для выращивания дрожжей, отличающаяся от вдвое большим 4 содержанием глюкозы
ВВЕДЕНИЕ


Данная работа посвящена изучению взаимосвязи формирования I с другими процессами, протекающими в клетках дрожжей, такими, как биогенез клеточной стенки и сворачивание секретируемых белков. Ранее в нашей лаборатории был получен штамм, несущий мутацию в гене 4 i . Эта мутация приводит к нарушению синтеза I I . Эго позволило предположить наличие у белка 4 дополнительных функций. Таким образом, целью данной работы было прояснение физиологической роли белка 4, в связи с чем представлялось интересным выявить гены, функционально связанные с геном 4, и выяснить причины возникновения у мутации в гене 4 фенотипических проявлений, не связанных явным образом с нарушением синтеза I. В отличие от клеток млекопитающих, клетки дрожжей vii окружены клеточной стенкой КС. Эта структура составляет от до сухого веса клетки и занимает от до ее объема см. Действительно, КС может защищать клетку от воздействия гидролитических ферментов окружающей среды, а, кроме того, может участвовать в межклеточных взаимодействиях, таких, например, как флоккуляция. На фотографиях, полученных с помощью электронного микроскопа, КС . Основные компоненты КС этого вида дрожжей это Р1,3глюканы, выполняющие основную структурную функцию, р1,6глюканы и маннопротеины. Кроме того, в КС в небольших количествах присутствует хитин. Глюканы и хитин образуют внутренний электроннопрозрачный слой клеточной стенки, при этом хитин расположен в основном ближе к плазматической мембране, а повышенное содержание 1,6глюканов наблюдается в наиболее удаленной от плазматической мембраны части электроннопрозрачного слоя. Это согласуется с тем, что р1,6глюканы участвуют в заякоривании маннопротеинов в клеточной стенке. Именно внутренний слой КС определяет механическую прочность этой структуры см. Внешний электронноплотный слой клеточной стенки образован в основном маннопротеинами. Маннопротеиновый слой КС определяет ее проницаемость для макромолекул см. КС. Каждая молекула глюканов этого типа содержит около остатков глюкозы, образующих длинные цепи с изредка встречающимися точками ветвления по 6ой гидрокси группе глюкозы см. Нерастворимость в щелочах, повидимому, отражает наличие 1,4связей между восстанавливающими концами хитиновых цепей и невосстанавливаюшими концами цепей р1,3глюканов а. Р1,6глюканы составляют около веса КС. Каждая молекула глюканов этого типа состоит примерно из 0 остатков глюкозы, образующих сильно разветвленные молекулы см. Подобно Р1,3гшоканам, Р1,6глюканы также могут быть связаны с хитином, при этом, повидимому, образуются 1,2 или 1,4связи между восстанавливающими концами хитиновых цепей и р1,3связанными ветвями р1,6глюканов. Кроме того, восстанавливающие концы молекул Р1,6глюканов, повидимому, образуют связи с невосстанавливающими концами молекул Р1,3глюканов . Маннопротеины составляют около веса КС см. Некоторые из них, повидимому, связаны с р1,6глюканами через фрагмент 5 остатков маннозы, соединенных а связями I якоря . Хитин составляет лишь веса КС. Этот компонент представлен линейными молекулами длиной около 0 остатков . Уацетилглюкозамина см. Большая часть хитина сосредоточена в области септы . КС, повидимому, состоит из своеобразных строительных блоков, каждый из которых в среднем содержит 1 цепь р1,3глюкана, несущую точек ветвления, молекулы р1,6глюкана и столько же молекул маннопротеинов, кроме того, в некоторых таких блоках присутствует хитин. Более полная характеристика структуры и состава КС изложена в обзорах i, i . Клеточная стенка является динамической структурой, меняющейся в зависимости как от внутренних причин, таких, например, как фазы клеточного цикла, так и от внешних условий, таких как температура, среды и др. В обзоре литературы будет кратко описан синтез основных компонентов КС, при этом, основное внимание будет уделено формированию I якоря. Кроме того, поскольку многие сскретируемые белки или непосредственно участвуют в образовании маннопротеинового слоя КС см. Vi, , в данном обзоре будут также рассмотрены механизмы контроля качества сворачивания секретируемых белков.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.198, запросов: 145