Клонирование и характеристика генов, вовлеченных в регуляцию биосинтеза клеточной стенки дрожжей

Клонирование и характеристика генов, вовлеченных в регуляцию биосинтеза клеточной стенки дрожжей

Автор: Пакайзер, Анна Николаевна

Шифр специальности: 03.00.15

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2000

Место защиты: Москва

Количество страниц: 123 с. ил

Артикул: 3294248

Автор: Пакайзер, Анна Николаевна

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Клеточная стенка дрожжей.
1. Строение и функции клеточной стенки.
2. Структура и биосинтез хитина.
3. рглюканы клеточной стенки.
3.1 Биосинтез Р1,6глюканов.
3.2 Биосинтез р 1,3глюканов.
4. Маннопротеины клеточной стенки.
4.1 Модификации белков клеточной стенки в путях секреции.
4.1.1 Импорт в эндоштазматический ретикулум.
4.1.2 Агликозилирование. .
4.1.3 Огликозилированис.
4.1.4 Особенности гликозилирования белков в клетках Напбепи1а роутогрИа.
4.1.4. Присоединение гликозилфосфатидилинозитола.
4.2. Транспорт маннопротеинов к клеточной стенке.
4.3. Механизмы встраивания белков в клеточную стенку.
5. Регуляция биосинтеза клеточной стенки. РКСкаскад. ,
5.1 Протеинкиназы РКСкаскада.
5.2 Регуляция РКСкаскада.
5.3 Мишени действия протеинкиназ РКСкаскада.
5.3.1 Белки, участвующие в биосин тезе клеточной стенки.
5.3.2 Актиновый цитоскелет.
6. Заключение. Постановка задачи исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Штаммы микроорганизмов.
1.1 Штаммы дрожжей.
1.2 Штаммы бактерий.
2. Плазмиды, использованные в работе.
2.1 Плазмиды, полученные другими авторами.
2.2 Плазмиды, полученные в данной работе.
3. Состав сред и условия культивирования микроорганизмов.
3.1 Среды для выращивания ii i.
3.2 Среды для выращивания vii.
3.3 Среды для выращивания .
3.4 Условия культивирования.
4. Генетические методы.
4.1 Методы частной генетики дрожжей.
4.2 Трансформация клеток микроорганизмов.
5. Клонирование и секвенирование.
6. Выделение и анализ ДНК дрожжей.
6.1 Выделение ДНК из клеток . vii.
6.2 Выделение ДНК из клеток . .
7. Выделение и анализ РНК из клеток . vii.
8. Определение ферментативных активностей.
8.1 Тестирование ферментативной активности урокиназы.
8.2 Оценка активности щелочной фосфатазы.
8.3 Определение активности алкогольдегидрогеназы.
9. Электрофорез белков, зимография и иммуноблоттинг.
9.1 Зимография урокиназы.
9.2 Зимография инвертазы.
9.3 Электрофоретическое выявление хитиназы.
9.4 Иммуноблоттинг.
. Микроскопия.
.1 Световая и флюоресцентная микроскопия.
.2 Трансмиссионная электронная микроскопия.
. Определение чувствительности клеток дрожжей к различным агентам.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
I Изучение гена . vii.
1. Геиетическая характеристика мутации .
2. Клонирование и характеристика гена ОТ2.
2.1 Клонирование гена .
2.2 Определение нуклеотидной последовательности гена и характеристика белкового продукта.
2.3 Конструирование нулевой аллели гена .
3. Выяснение причин сверхсекреции урокиназы клетками зьи мутанта.
3.1 Определение количества мРНК урокиназы в клетках мутанта.
3.2 Зависимость количества секретируемой урокиназы от осмотического
давления в культуральной среде.
4. Выявление осмотической нестабильности и лизиса клеток 8яи мутанта.
4.1 Проверка чувствительности к БОБ.
4.2 Оценка внеклеточной активности ферментов, в норме локализованных
внутри клеток.
5. Выявление нарушений клеточной стенки Я8и мутанта и выяснение
природы нарушений.
5.1 Определение чувствительности к СРУ, зимолиазе и киллерным
токсинам К1 и НМ1.
5.2 Сравнение соотношений глюкозы и маннозы в клеточных стенках
мутанта и штамма дикого типа.
5.3 Оценка степени гликозилирования белков, секретируемых клетками
мутанта. ,
5.4 Электронномикроскопическое исследование структуры клеточных
стенок.
6. Определение внутриклеточной локализации белка 8зир.
6.1 Доказательства функциональности химерного белка 8ирЕОРР.
Определение внутриклеточной локализации этого белка.
6.2 Определение локализации химерного белка 8и рЕСРР в клетках
штамма с мутацией ЛьнЮ.
6.3 Исследования генетических взаимодействий мутаций зи и ЬянЮ.
7. Факты, указывающие на взаимодействие белка 8зир с РКС
протеинкиназным каскадом.
7.1 Оценка чувствительности клеток мутанта к повышенной температуре, тепловому шоку, кофеину и стауроспорину.
7.2 Генетические взаимодействия и РКС1.
7.3 Влияние мутации на клеточный метаболизм Са2 и 2.
7.4 Влияние мутации 2 на клеточную локализацию белка 2.
II Изучение гена Н. тог.
1. Генетическая характеристика мутации ори.
2. Клонирование и характеристика гена .
2.1 Клонирование гена 4.
2.2 Определение нуклеотидной последовательности гена и
характеристика белкового продукта.
3. Изучение влияния мутации ори на гликозилирование секретируемых
белков.
3.1 Исследование Огликознлирования на примере гомологичной хитиназы.
3.2 Исследование iVгликозилирования на примере гетерологичной
инвертазы.
4. Выявление нарушений клеточной стенки ори мутанта.
4.1 Осмотическая нестабильность клеток и повышенная проницаемость
клеточной стенки к антибиотику генитицину.
4.2 Повышенная чувствительность клеток к зимолиазе.
4.3 Элекфонномикросконические исследования нарушений клеточной
стенки мутанта.
5. Выяснение причин сверхсекреции урокиназы клетками ори мутанта.
5.1 Оценка эффективности секреции урокиназы при росте клеток на
осмотически стабилизированной среде.
5.2 Проверка влияния гликозилирования урокиназы на эффективность ее
секреции.
5.3 Оценка чувствительности клеток мутанта к агентам, нарушающим
фолдинг секретируемых белков в эндоплазматическом ретикулуме.
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поиск мутантов с ослабленной клеточной стенкой среди штаммов,
имеющих сверхсекреторный фенотип. Причины сверхсекреции
урокиназы клетками мутантов 5яи и ори.
2. Роль белка 8и р в биосинтезе клеточной стенки сегеае.
3. Участие ГТФманноза пирофосфорилазы И. ро1утогрка, кодируемой геном
ОРШ4, в процессах биосинтеза клеточной стенки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


С другой стороны, у дрожжей получены представительные коллекции мутантных штаммов, несущих охарактеризованные мутации по различным генам, так что в зависимости от экспериментальных задач при помощи скрещивания можно получать штаммы с заданной комбинацией мутантных локусов. К настоящему времени расшифрованы последовательности всех генов дрожжей vii, что сильно упрощает рабо ту как с этим организмом, гак и с дрожжами других видов. Наконец, дрожжи нетребовательны к условиям культивирования и быстро растут. В последние годы благодаря изучению, в основном, дрожжей . Несмотря на внешнюю простоту дрожжевой клетки, механизмы, определяющие форму клетки, ее размер и полярность, оказались общими для дрожжей и высших эукариот. Размер и форма дрожжевых клеток определяются, в основном, клеточной стенкой, жесткой структурой, окружающей клетку. Наличие клеточной стенки характерно для клеток растений, бактерий и грибов. Изучение строения и формирования клеточной стенки представляет интерес по двум причинам. С чисто академической точки зрения, поскольку эта структура определяет форму клеток, она является удачной моделью для изучения клеточного морфогенеза. Механизмы, регулирующие биосинтез клеточной стенки, оказываются напрямую связаны с такими фундаментальными клеточными процессами, как рост, деление, секреция, ответ клетки на стресс. Поэтому многие гены, контролирующие биосинтез клеточной стенки дрожжей, имеют гомологов в клетках млекопитающих. С практической точки зрения, клеточная стенка, будучи характерной особенностью грибов и бактерий в том числе и паразитов животных и человека, может служить отличной мишенью для разработки антибактериальных и противогрибковых препаратов. Открытие механизмов заякоривания собственных белков дрожжей в клеточной стенке позволило иммобилизовать на ней и гетерологичные белки, используя затем такие штаммы для создания оральных вакцин иммобилизация антигенов, систем очистки белков иммобилизация антител, взаимодействующих с нужным белком, систем очистки воды от тяжелых металлов иммобилизация белков, связывающих тяжелые металлы. Изучение регуляции биосинтеза клеточной стенки дрожжей возможно, прежде всего, путем получения мутантов с нарушенной клеточной стенкой, клонирования соответствующих генов и изучения влияния данных мутаций как непосредственно на структуру и состав клеточной стенки, так и на другие клеточные процессы, такие как ионный гомеостаз, секреция белков, чувствительность клетки к различного рода стрессам и т. Предлагаемая работа посвящена изучению двух новых генов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки, один из которых клонирован из генома классического объекта генетики 5. Натепи1а роутогрНа. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Клеточная стенка дрожжей. I. Строение и функции клеточной стенки. На долю клеточной стенки приходится сухого веса клетки. Биосинтез такого количества органического вещества требует значительных энергетических затрат, что может свидетельствовать о важности этой структуры для клетки. Действительно, клеточная стенка осуществляет множество функций вопервых, играет роль наружного клеточного скелета, определяя форму клетки и предохраняя ее от лизиса в гипотонических условиях вовторых, клеточная стенка это барьер, который, с одной стороны, защищает клетку от разрушающего действия ферментов внешней среды, а с другой задерживает собственные белки клетки, находящиеся в периплазме наконец, в третьих, клеточная стенка определяет такую функцию клетки, как рецепция, и межклеточные взаимодействия. Основными компонентами клеточной стенки дрожжей являются полимеры глюкозы рглюканы по характеру химических связей делятся на р ,3 и ,6глюканы и маннопротеины белки клеточной стенки, как правило, сильно гликозилированные гликозидные цепи маннопротеинов называются маннанами. Кроме того, в состав клеточной стенки в небольших количествах входит полимер Иацетилглюкозамина хитин. На фотографиях, полученных при помощи электронного микроскопа, клеточная стенка выглядит как двуслойная структура Рис. Рисунок 1. Строение клеточной стенки дрожжей Я. Иа. М манно протеиновый слой, Г глюкановый слой.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.196, запросов: 145