Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Автор: Самбук, Елена Викторовна

Шифр специальности: 03.00.15

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2006

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 262 с. ил.

Артикул: 3307768

Автор: Самбук, Елена Викторовна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
Глава I. Генетический контроль метаболизма углерода, азота и фосфора у дрожжей vii Обзор литературы
1.1. Генетические механизмы регуляции метаболических путей и принципы построения регуляторных моделей у эукариот.
1.2. Метаболизм углерода и генетические механизмы, обеспечивающие адаптацию клеток дрожжей . vii к наличию и отсутствию глюкозы в среде
1.2.1. Транспорт глюкозы и пути переноса сигнала о наличии глюкозы в среде
1.2.1.1. Семейство генов ЯЛТ и регуляция их транскрипции.
1.2.1.2. Система мембранных рецепторов глюкозы, взаимодействующих
с ГТФ связывающими белками.
1.2.2. Генетический контроль глюкозной индукции генов, кодирующих ферменты гликолиза.
1.2.3. Генетический контроль регуляции глюкозной репрессии.
1.2.3.1.Репрессор i
1.2.3.2. Структура и функции регуляторного комплекса
1.2.3.3. Регуляция экспрессии гена 2, кодирующего структуру алкогольдегидрогеназы
1.2.3.4. Регуляция транскрипции генов, кодирующих ферменты цикла
Кребса.
1.3. Генетический контроль метаболизма азота у дрожжей vii.
1.3.1. Роль источников азота в регуляции продолжительности стадий клеточного цикла у дрожжей . vii.
1.3.2. Центральный путь азотного метаболизма у дрожжей.
1.3.3. Генетический контроль регуляции основных ферментов азотного метаболизма.
1.3.3.1. Регуляция транскрипции 1.
1.3.3.2. Регуляция транскрипции 1.
1.3.3.3. Регуляция транскрипции 2.
1.3.3.4. Регуляция транскрипции 1.
1.3.4. Генетический контроль азотной катаболитной репрессии
1.3.4.1. Белки регуляторы азотного метаболизма
1.3.5. Пути передачи информации о количестве и качестве источника азота в среде у дрожжей
1.3.5.1. Филаментозный рост у дрожжейсахаромицетов как пример генетического контроля формирования адаптивных
модификаций.
1.3.5.2. Система, воспринимающая пищевые сигналы .
1.3.5.3. Дискриминационный путь
1.3.6. Генетический контроль утилизации пролина
1.4. Генетический контроль метаболизма фосфора у дрожжей
. vii
1.4.1. Метаболизм фосфора у дрожжей
1.4.2. Биохимическая характеристика КФ.
1.4.3. Генетический контроль регуляции кислых фосфатаз
дрожжей ПГЛ
1.4.3.1. Генетический контроль синтеза КФ1.
1.4.3.2. Генетический контроль синтеза КФ2 и КФЗ.
1.4.4. Механизмы мембранного транспорта Ф у дрожжей.
1.4.5. Пути передачи сигнала о концентрации фосфата
1.4.6. Регуляторные белки регулона РНО.
1.4.6.1. Позитивные регуляторы.
1.4.6.2. Негативные регуляторы.
1.4.6.3. Модель регуляции экспрессии генов регулона
Глава И. Материалы и методы
2.1. Основные обозначения.
2. 2. Основные штаммы и условия их культивирования
2. 2.1. Штаммы и плазмиды.
2. 2.2. Условия культивирования штаммов.
2.3. Методы
2.3.1.Генетические методики.
2.3.2. Биохимические методики.
2.3.2.1.Определение активности кислых фосфатаз
2.3.2.2. Качественное определение уровня гликогена
2.3.2.3.0пределение активности р галактозидазы у дрожжей
2.3.2.4. Приготовление экстракта белков дрожжей сегеуяае
2.3.2.5. Гибридизация белков с фрагментом промотора гена СТ .
2.3.2.6. Выделение и очистка тропомиозина в составе фракции термостабильных белков.
2.3.3. Цитологические методики
2.3.3.1. Визуализация митДНК с помощью БАР
2.3.3.2. Окраска дрожжей родамин фаллоидином.
2.3.3.3. Получение и обработка цифровых изображений
2.3.4. Молекулярнобиологические методики
2.3.4.1. ПЦР с праймерами к гену РН5.
2.3.4.2. Секвенирование фрагментов ДНК.
2.3.5. Статистическая обработка результатов
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структурнофункциональная характеристика киназы Р1юр и генетический анализ плейотропных эффектов мутаций рко
3.1.1. Установление аллельности генов АСР и РН
3.1.2. Фенотипическая характеристика мутантов рко
3.1.3. Структурно функциональный анализ мутаций рИо
3.1.4. Поиск генов, кодирующих шапероны комплекса
3.1.4.1. Генетический анализ спонтанных супрессорных мутаций, подавляющих проявление 3 и
3.1.4.2. Рекомбинационный тест мутаций .ИЗ
3.1.5. Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций .
3.1.5.1. Генетическая нестабильность ядерного и митохондриального геномов новый плейотропный эффект мутаций .
3.1.5.1.1. Определение количества генов, в которых возникают мутации на фоне дизрупции гена РН5.
3.1.5.1.2. Влияние дизрупции гена РН5 на распределение митохондриальных нуклеоидов между материнской
клеткой и почкой
3.1.5.1.3. Влияние дизрупции РН5 на структуру цитоскелета
3.1.5.1.4. Влияние дизрупции РН5 на спектр термостабильных белков
3.2. Поиск регуляторных путей, связывающих метаболизм азота и фосфора у дрожжей.
3.2.1. Изучение роста мутантов на средах с различными источниками азота.
3.2.2. Генетический анализ признака неспособность к утилизации пролина
3.2.3. Влияние мутаций на транспорт пролина.
3.2.4. Влияние мутаций 4 на рост мутантов на среде с пролином
3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов генов катаболизма пролина.
3.3. Поиск регуляторных путей, связывающих метаболизм углерода
и фосфора у дрожжей . vii
3.3.1.Определение зависимости экспрессии гена I1 от концентрации
фосфата и дизрупции гена РН5.
3.3.2. .Поиск белков, взаимодействующих с областью промотора гена С, ответственной за глюкозную репрессию.
3.4. Зависимость экспрессии гена , кодирующего структуру белкашаперона от концентрации фосфата в среде и мутаций в генах РНО
3.4.1. Получение изогенных штаммов с мутациями в генах РНО и их генетический анализ
3.4.2. Влияние концентрации фосфата и мутаций в генах РНО на транскрипцию .
3.5. Идентификация ортолога гена РН5 дрожжей iii
3.5.1. Получение штаммов с дизрупцией гена РН5 у дрожжей
. i
3.5.2. Изучение фенотипического проявления дизрупции в гене РН5Рр
3.5.3. Изучение функций ортологов у представителей разных
эволюционных групп.
Глава IV. Роль фосфопротеинкиназ , , i,2 в реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей Заключение.
4.1. Координация метаболизма в ответ на лимитирующий фактор
4.1.1. Координация метаболизма при азотном
голодании
4.1.1.2. Изменения метаболизма углерода в ответ на недостаток азота
4.1.1.3. Недостаток азота и метаболизм фосфора.
4.1.2. Координация метаболизма при недостатке источника углерода.
4.1.2.1. Глюкозное голодание и метаболизм азота
4.1.2.2. Глюкозное голодание и метаболизм фосфора
5.1.3. Координация метаболизма при недостатке фосфора
5.1.3.1. Недостаток фосфата и метаболизм азота
5.1.3.2. Недостаток фосфата и метаболизм углерода.
5.2. Влияние лимитирующего фактора на клеточный цикл
5.3. Лимитирующий фактор и его роль в формировании адаптивных
мутаций.
Список литературы.
Список использованных сокращений
а КГ акетоглутаровая кислота АДФ аденозин5дифосфат АТФ аденозин5трифосфат ГДФ гуанозин5дифосфат ГТФ гуанозин5трифосфат ДСН додецилсульфат натрия ДТТ дитиотреитол константа Михаэлиса КФ кислая фосфатаза
НАД никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма НАДН никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма НАДФН никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленная форма
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
УДФ уридин5дифосфат
цАМФРКА цАМФзависимая протеинкиназа А
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
глюкозная катаболитная репрессия i
i
циклинзависимая киназа i i
1,4 диазобициклооктан
I 4,6 диамидино2фенилиндолдигидрохлорид
рецепторы, взаимодействующие с ГТФсвязывающими белками iI
белки теплового шока
азотная катаболитная репрессия i i i фенилметилсульфонилфторид
регуляторная активирующая последовательность промотора регуляторная репрессирующая последовательность промотора
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Для дрожжей наиболее предпочтительными источниками углерода являются глюкоза и фруктоза. Наличие глюкозы в среде приводит как к глюкозной индукции генов, кодирующих белкипереносчики глюкозы и ферменты гликолиза, так и к глюкозной катаболитной репрессии i i ингибированию синтеза ферментов, необходимых для утилизации других сахаров. Отсутствие глюкозы или ее недостаток оказывает огромное влияние на метаболизм клетки в целом. Показано, что глюкозное голодание приводит к репрессии ,1 генов генома дрожжей. При этом транскрипция 8 генов повышена более, чем в 5 раз . Таким образом, видно, что дрожжи адаптируются к внешним условиям, изменяя уровень экспрессии соответствующих генов. Схема метаболизма углерода у дрожжей и гены, кодирующие соответствующие ферменты, представлены на рис. У дрожжей существует несколько систем, позволяющих получать информацию о наличии глюкозы в среде, а также способных распознавать и дифференцировать широкий спектр ее концентраций. У дрожжейсахаромицетов важную роль в ответе на наличие глюкозы в среде играют белкипереносчики глюкозы, локализованные в мембране клеток. Идентифицировано генов НХТ1 НХТ , 2, 3, 2, кодирующих потенциальные переносчики глюкозы. Км тМ , . В настоящее время только для 7 генов НХТ, доказано, что они кодируют истинные переносчики глюкозы. Штамм, мутантный по всем семи генам НХТ, не растет на среде с глюкозой, фруктозой, маннозой и не способен к гликолизу. Остальные гены НХТ, повидимому, кодируют минорные формы транспортеров i . Таким образом, транспортные белки избыточны, что позволяет дрожжам адаптироваться к любой концентрации глюкозы. Ген 2 кодирует белок, способный транспортировать галактозу и глюкозу. Введение гена 2 в составе плазмид компенсирует дефекты мутантов x i . Гены 2 и 3 кодируют мембранные белки, играющие роль сенсоров глюкозы, которые генерируют внутриклеточный сигнал для обеспечения транскрипции генов НХТ, соответствующих данной концентрации. Следует отметить, что дрожжи синтезируют только те переносчики глюкозы, которые соответствуют ее концентрации в среде. Так, на среде с неферментируемыми источниками углерода активируется синтез переносчиков с высоким сродством к глюкозе x6 и x7. При повышении концентрации глюкозы их синтез ингибируется, но активируются переносчики с промежуточным сродством x2 и x4. При высокой концентрации глюкозы активируется транскрипция генов, кодирующих переносчики глюкозы с низким сродством к глюкозе x и x3 см. Индукция только высокой концентрацией глюкозы НХТ1. Уровень экспрессии генов НХТ1 НХТ4 при наличии глюкозы в среде повышается в 0 раз . Причиной этого является ингибирование репрессора . В процессе принимает участие белок убиквитинлигаза . В дополнение к репрессии, опосредованной , гены НХТ2, НХТ4 контролируются и глюкозной репрессией, осуществляемой белком i vi, , , рис. Максимальная экспрессия гена НХТ1 требует участия белков, индуцируемых высокой концентрацией глюкозы, компоненты этой системы еще не обнаружены. НКХ2 Важную роль в передаче сигнала о наличии глюкозы в среде играет гексокиназа II ЕС 2. НКХ2 ii . Гексокиназа II является одним из трех ферментов, фосфорилирующих глюкозу и превращающих ее в глюкозо6фосфат, соединение, необходимое для катаболитной репрессии , . В клетке дрожжей гексокиназа II существует и в виде мономеров и димеров. Мономерная форма, в отличие от димерной, фосфорилирована. Фосфорилирование Нхк2р зависит от источника углерода. На среде с галактозой, раффинозой и этанолом мономер Нхк2р фосфорилирован сильнее, чем на среде с глюкозой. I viv добавление глюкозы в среду ведет к дефосфорилированию и активации Нхк2р. В дефосфорилировании мономеров Нхк2р участвуют и 7, субъединицы протеинфосфатазы I i . Делеция НКХ2 резко изменяет физиологию клетки дрожжей, приводит к снижению скорости роста в среде с высокой концентрацией глюкозы и отсутствию синтеза этанола. Интересно отметить, что в двугибридной системе обнаружено взаимодействие Нхк2р с циклином Рср, образующим комплекс с киназой . Такое взаимодействие может влиять на активность или формирование циклинкиназного комплекса I2 на среде с глюкозой.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.277, запросов: 145