Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих

Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих

Автор: Федорова, Елена Михайловна

Шифр специальности: 03.00.15

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2008

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 177 с. ил.

Артикул: 4115643

Автор: Федорова, Елена Михайловна

Стоимость: 250 руб.

Введение
Список сокращений
1. Обзор литературы
1.1. Модификации гистонов, характерные для эухроматина
и гетерохроматина
1.2. Регуляция транскрипционной активности белками
1.3. Взаимодействия между элеменгами у i
1.4. Архитектура ядра и регуляция работы генов
2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Химикалии, культуральные среды и добавки
2.1.2. Ферменты
2.1.3. Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты и векторы
2.1.4. Антитела и конъюгаты
2.1.5. Красители и маркеры
2.1.6. Киты
2.1.7. Буферы и растворы
2.1.8. Микроскопы
2.1.9. Программы для обработки изображений
2.1 Линии мух i
2 Мухи дикого типа
2 Трансгенные мухи
21. Трансгенные конструкции , 5 и 6
22. Трансгенные линии мух
2.1 Линии клеток
2 Клетки i
2 Клетки человека
2 Клетки свиньи
21. Клетки свиней дикого типа
22. Клетки трансгенных свиней, имеющие лентивирусную конструкцию V
23. Линии клеток трансгенных свиней
2.2. Методы
2.2.1. Клетки млекопитающих
2.2.1.1. Культура клеток млекопитающих i vi
2.2.1.2. Посев клеток на покровные стекла
2.2.1.3. Фиксация клеток метанолом и уксусной кислотой
2.2.1.4. Фиксация клеток формальдегидом
2.2.1.5. Иммуноокрашивание клеток, фиксированных формальдегидом
2.2.1.6. Флуоресцентная i i гибридизация I
2.2.1.6.1. Мечение проб
2.2.1.6.2. Ферментативная деградация ПЦРмеченых проб
2.2.1.6.3. Осаждение проб ДНК
2.2.1.6.4. Денатурация и гибридизация
2.2.1.6.5. Детекция
2.2.1.7. РНКинтерференция
2.2.1.8. Экспрессия в клетках
2.2.2. Клетки и ткани i
2.2.2.1. Культура клеток i
2.2.2.2. Содержание мух i
2.2.2.3. Препарирование личиночных тканей i
2.2.2.4. Фиксация клеток формальдегидом
2.2.2.5. Иммуноокрашивание фиксированных формальдегидом клеток Кс
2.2.2.6. Иммуноокрашивание тканей i
. Флуоресцентная i i гибридизация I
2.2.2.7.1. Подготовка проб
2.2.2 Мечение проб
.3. Эффективность мечения и специфичность проб
2.2.2.7.4. Осаждение проб
2.2.2.7.5. I на политенных хромосомах
2.2.2.7.6. I на тканях личинок
2.2.2.7.7. I на фрагментах тканей
2.7.7Л. Протокол А
2.2.2.7 Протокол В
2.2.3. Анализ изображений
2.2.3.1. Анализ изображений ядер, фиксированных метанолом
уксусной кислотой
2.2.3.2. Анализ изображений ядер, фиксированных формальдегидом
2.2.3.2.1. Измерение расстояний между двумя генами
2.2.3.2.2. Измерение расстояний между геном и ядерной ламиной
хромоцентром
2.2.3.2.3. Коррекция расстояний
2.2.3.3. Анализ трехмерной организации фокусов белка
3. Результаты
3.1. Локализация генов и трансгенов в интерфазных ядрах клеток
личиночных тканей i
3.1.1. Пространственная организация хроматина в ядрах i
3.1.2. Локализация генов и трансгенных конструкций в интерфазном
ядре i
3.1.2.1. Неактивные гены
3.1.2.1.1. i
3.1.2.1.2.
3.1.2.1.3. ix x
3.1.2.2. Локализация 7содержащих трансгенов в ядре в разных
состояниях активности
3.1.2.2.1. Локализация трансгена 5 в ядрах личинок i
линии 1
3.1.2.2.2. Локализация трансгена в ядрах личинок линии 1
3.1.2.2.3. Локализация трансгена 6 в ядрах личинок линии 1
3.1.2.3. Положение в ядре других элементов в их активном и неактивном состояниях
3.1.3. Существует ли физическое взаимодействие между гомологичными элементами
3.1.3.1. Локализация эндогенной и трансгенной копий 7 элемента относительно друг друга в ядрах клеток различных тканей
личинок 1
3.1.3.2. Эндогенная и трансгенная копии 7 в ядрах личинок линии 5 ,2 влияет ли температура развития мух на предполагаемые взаимодействия
3.1.3.3. Важна ли хромосомная локализация трансгенной копии 7 Измерения расстояний между эндогенным и трансгенным 7 элементами в ядрах клеток различных тканей личинок 1
3.1.4. Пространственное распределение белка в интерфазных
ядрах клеток различных личиночных тканей
3.1.4.1. Ассоциация эндогенных связывающих сайтов с активной формой II2 на поверхности хромоцентра
3.2. Локализация активных v неактивных трансгенов V в ядрах
фибробластов трансгенных свиней
3.2.1. Иммортализованные клетки
3.2.2. Первичные культуры клеток
3.2.3. Активация трансгена V с помощью 5азацитидина
3.2.4. Локализация активного трансгена V в инфицированных
клетках
3.3. Роль белка Трг в локализации гена в ядрах клеток
3.3.1. Влияние посттранскрипционной инактивации белка Трг на локализацию в ядрах клеток
3.3.2. Отсутствие Трг приводит к перемещению , не вызывая его транскрипционной активации
4. Обсуждение
4.1. Локализация элемента 7 в ядрах i
4.1.1. Организация хромоцентра в ядрах различных типов клеток i
4.1.2. Пространственная организация эухроматиновых модификаций гистонов в интерфазных ядрах личиночных тканей i
4.1.3. Расположение активных сайтов на поверхности хромоцентра
4.1.4. Локализация неактивных генов в ядрах личиночных тканей i
4.1.5. Положение активных и неактивных 7содержащих трансгенов
в ядрах клеток личиночных тканей i
4.1.6. Есть ли физический контакт между гомологичными элементами
в ядрах клеток личиночных тканей i
4.1.6.1. Политенные v обычные хромосомы, тип ткани и взаимодействия эндогенных и трансгенных 7 элементов
4.1.6.2. Влияют ли положение на хромосоме и температура на взаимное расположение копий элемента 7 в ядре
4.1.7. Трехмерная ядерная организация Рссвязывающих сайтов у i трудности интерпретации
4.2. Сайт интеграции и транскрипционная активность определяют ядерную
локализацию трансгенов V в клетках свиней
4.3. Белок Трг, ассоциированный с комплексами ядерных пор, принимает
участие в периферической локализации неактивных генов в клетках человека Выводы Благодарности Список литературы
Введение
Актуальность


Более того, ди и триметилированные изоформы НЗК4 далее димНЗК4 и тримНЗК4, соответственно имели схожее распределение в хроматине и были в основном ассоциированы с активными участками i . Похожие результаты в отношении димНЗК4 и тримНЗК4 были получены в ходе анализа активных и неактивных генов в ядрах эритроцитов цыпленка i . Это позволяет предположить, что ассоциация димНЗК4 и тримНЗК4 с активными генами может различаться у дрожжей и животных. Признаками транскрипционной активности также является метилирование гистона НЗ по лизинам и . В отличие от вышеописанных модификаций, метилирование гистона НЗ по лизинам 9 и и гистона Н4 по лизину маркирует гетерохроматин и транскрипционно неактивный эухроматин . У i конститутивный гетерохроматин обогащен гистоном НЗ, диметилированным по лизину 9 далее димНЗКЭ . У млекопитающих эта фракция гетерохроматина маркирована триметилированным НЗК9 и Н4К . НЗ, тетраметилированным по лизину 9 . Выборочное метилирование гистона НЗ по К9 производится специфичными гистоновыми метилтрансферазами. Ген v принадлежит к классу геновмодификаторов эффекта положения. Эффект положения проявляется при транслокации эухроматинового гена в соседнюю с гетерохроматином область, что приводит к выборочной инактивации и мозаичной экспрессии этого гена Жимулев, i, iii, i, i, . Предполагается, что инактивация происходит вследствие распространения компактизированного состояния хроматина на такие перемещенные фрагменты хромосом , i, ivi, , . Существует группа генов, в которых мутации с потерей функции i приводят к подавлению эффекта положения. У i и дрожжей было найдено таких генов, которые имеют общее название v i vii , i, . Мутации в 4, который является гомологом v у . Ivv . Недавние исследования показали, что v это гистоновая метилтрансфераза, специфичная для НЗК9. Гомологи v у человека V1, мышей v1 и дрожжей 4 также кодируют метилтрансферазы, специфичные для НЗК9 . Было показано, что гистоновые метилтрансферазы класса V имеют два высококонсервативных домена домен и хромодомен i ii ii i, i. V i, белка группы и белка ixгруппы X i . V, катализирует метилирование НЗК9, в то время как домен белка 1 xбелок метилирует исключительно НЗК4 i . Для функционирования домена необходимы примыкающие к нему обогащенные цистеином последовательности . Однако, хотя у различных видов известно множество белков, содержащих домены i , i . Хромодомен был изначально идентифицирован как последовательность из аминокислот, общая для белка Рс белки и гетерохроматинового белка НР1 i i 1 i Раю, , i . Хромодомен белка 1 имеет высокую аффинность связывания с метилированным НЗК9 i . V i . V1 и v1 гомологи V у человека и мыши, соответственно . НР1 . Таким образом, НР1 и его гомологи образуют комплексы с соответствующими гистоновыми метилтрансферазами, которые в свою очередь создают специфический субстрат для связывания НР1, что обеспечивает распространение гетерохроматиновой структуры i, . В то время как хромодоменный белок НР1 связывается с конститутивным гетерохроматином у i , хромодоменный белок Рс не связывается с этой фракцией хроматина, но обнаруживается примерно на 0 эухроматиновых участках политенных хромосом слюнных желез и в ядрах эмбрионов i, Раго, i . Было показано, что метилированный НЗК это специфический маркер, распознаваемый хромодоменом белка i . НР1 Раго, , . Рс и другие белки необходимы для поддержания репрессированного состояния эухроматиновых генов. В следующем разделе возможные механизмы такой зависимой репрессии рассмотрены более подробно. В период раннего эмбриогенеза i паттерны экспрессии Нохгенов определяются различными регуляторными каскадами I, i i, . На последующих стадиях развития активное или репрессированное состояние Нохгенов поддерживается двумя антагонистическими группами белков белками x, необходимыми для поддержания активного состояния генов, и белками , необходимыми для поддержания репрессивного состояния i, i, i, i, Раго, . Белки работают в виде трех мультибелковых комплексов. Рс, i , i x , x x , также известный как II и некоторые компоненты механизма базальной транскрипции . I i vi . НЗК i vi i .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.276, запросов: 145