Трансформация стероидных соединений актинобактериями

Трансформация стероидных соединений актинобактериями

Автор: Донова, Марина Викторовна

Год защиты: 2006

Место защиты: Пущино

Количество страниц: 262 с. 23 ил.

Артикул: 4304847

Автор: Донова, Марина Викторовна

Шифр специальности: 03.00.07

Научная степень: Докторская

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Трансформация стероидных соединений пктинобактернями.
Г идроксилирование.
Дегидрирование
Гидрирование .
Эпоксидирование.
Окисление спиртовв кетоны или альдегиды.
Гидролиз стероидных эфиров.
Окисление кетонов в эфиры и лактоны реакция БайераВиллигера.
Восстановление карбонильных соединений.
Деградация
Трансформация стеринов.
Стерины и источники их получения.
Микробиологическая трансформация стеринов
Деградация боковой цепи
Окисление стероидного ядра.
Методы предотвращения деструкции стероидного ядра
Ферменты модификации стероидного ядра у
актшюбактернй.
Холсстеролоксидаза
3кетостероиддегидрогеназа 3КСД и получение штаммов с
блокированной активностью 3КСД
Индуцибельность 3КСД.
Свойства 3КСД.
Сходство строения и механизма действия 3КСД и других дегидрогеназ.
Субстратная специфичность 3КСД
Локализация 3КСД
Связь 3КСД с другими ферментными системами клетки.
Свойства 9агидроксилазы.
Свойства гидроксистсроиддсгидрогеназ ОНСДГ.
Физиологическая роль ОНСДГI
Субстратная специфичность ОНСДГ
Индукция бактериальных ОНСДГ.
Локализация ОНСДГ у микроорганизмов
Дезацетилированис и свойства стероидных эстсраз
Взаимодействие клеток актинобактернй с гидрофобными
стероидными субстратами
Строение клеточной стенки микобактерий и се
проницаемость.
Взаимодействие актинобактернй со стеринами.
Модификация структуры КС и трансформация стеринов
Трансформация стероидных соединений в присутствии
циклодекстринов ЦД.
ЦЦ и их применение.
Производные ЦД.
Константа стабильности комплексов ЦД с органическими
соединениями
Применение ЦЦ в биотехнологии
Применение ЦД в биотрансформации стероидов.
I
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы.
3.1.1 Перечень материалов, использованных в работе
3.1.2 СКАМ и получение препаратов на его основе.
3.2 Микроорганизмы и их культивирование.
3.2.1 Культивирование актинобактерий
3.3 Определение чувствительности микобактерий к антибактериальным
агентам
3.4 Селекция и мутагенез микобактерий.
3.4.1 Индукция мутаций
3.4.2 Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9ОНАД.
3.5 Трансформация стероидных соединений.
3.5.1 Трансформация стеринов и ДГЭА в колбах
3.5.2 Трансформация СКАМа и его препаратов
3.5.3 Трансформация стероидов андростанового и прегнанового ряда
3.6 Очистка стсроидтрансформируюших ферментов микобактерий
3.6.1 Очистка Зргидроксистероидоксидазы
3.6.2 Очистка 3кетостероиддегидрогеназы 3КСД
3.6.3 Очистка гидроксистероиддегидрогеназ ОНСДГ
3.7 Характеристики ферментов
3.8 Определение локализации ОНСДГ.
3.8.1 Получение сферопластов i . 1.
3.8.2 Определение локализации ОНСДГ фракционированием клеток
3.8.3 Определение локализации ОНСДГ цитохимической реакцией.
3.9 Фракционирование клеток ii ix ВКМ АсД.
3. Изучение влияния модифицированных циклодекстринов МЦД на
i
Влияние МЦД на рост и агрегацию микобактерий
Определение миколовых кислот
Определение свободных липидов.
Определение состава жирных кислот.
Определение углеводного состава полисахаридов клеточных стенок
3. Электронная микроскопия.
Просвечивающая электронная микроскопия
Метод замораживания скалывания
3. Физикохимические методы
Построение фазовых диаграмм растворимости стероидов в растворах ЦЦ.
Определение константы стабильности комплексов ЦД со стероидами
3. Аналитические методы
Выделение и очистка стероидов.
Анализ стероидов
4 Результаты н обсуждение.
4.1 Трансформация стероидных соединений актниобактериямн
4.1.1 Идентификация 7гидрокснлированных стероидов
4.1.2 Сопоставительный анализ 3КСД активности штаммов рода ii.
4.1.3 Сопоставительный анализ ОНСДГ активности штаммов i
и
4.1.4 Продукты трансформации ситостерина штаммами i
4.1.5 Трансформация различных стеринов микобактериями.
4.1.6 Трансформация стеринсодержащего отхода производства соевого масла
Трансформация скама
Биоконвсрсия препарата М.
Биоконверсия образцов скама, предобработанных химическими способами
Получение мутантных штаммов i
Определение чувствительности i . ВКМ Ас Д к
антибактериальным препаратам.
Получение мутантных штаммов из i . ВКМ ЛсД, определение их способности к росту па 3,дикетостероидах и деградации
боковой цепи ситостерина.
Трансформация 3,дикетостероидов мутантными штаммами.
Мутагенез и селекция штаммов, продуцирующих 9ОНАД
Получение мутантного штамма i . М.
Трансформация ситостерина мутантным штаммом i . М Трансформация 3,дикетостероидов мутантом i . М. Ферменты модификации стероидного ядра стеринтрансформнрующнх
микобактерии выделение, функции и свойства
ЗРгидроксистероидоксидаза 3СО
Очистка внеклеточной 3СО
Трансформация стероидов ферментными препаратами 3СО.
ОЫСДГ активность препаратов внеклеточных ферментов.
рГидроксистероиддегидрогеназа
Выделение, очистка и изучение свойств внутриклеточных ОНСДГ
Свойства внутриклеточных ОНСДГ.
Локализация ОНСДГ i .
Изучение локализации ОНСДГ методом фракционирования
Изучение локализации ОНСДГ цитохимическим методом
3Кстостсроиддсгидрогсназа i . ВКМ АсД
Дегидрирование 9ОНАД и АД.
Индукция 3КСД.
Очистка 3КСД
Трансформация стеринов микобактериями в присутствии МЦД
Биотрансформация стеринов в присутствии различных МИД
Константы стабильности комплексов стероидов с МЦД
Выяснение связи между основными показателями биотрансформации и физикохимическими характеристиками растворов МЦД. Гипотеза ЦД
емкости среды.
Влияние МЦД на деструкцию 9ОНАД i . ВКМ АсД
Доказательство образования комплекса включения 9ОНАД с МЦД.
Кинетические характеристики процесса дегидрирования 9ОНАД
Изучение доступности комплекса МЦД 9ОНАД для 3КСД.
Влияние МЦД на рост микобактерий, состав и проницаемость их
клеточной стенки.
Влияние МОД на рост i . ВКМ АсД.
Влияние МОД на адгезивные свойства клеток
Влияние модификаций КС на стеринтрансформнрующую активность
Взаимодействие клеток с субстратом в присутствии МЦД.
Ультраструктура клеток и клеточной стенки
Влияние МЦД на химический состав КС
Биоконвсрсия стероидов прегнанового ряда культурой ii
ix ВКМ Ас
Биоконверсия прсгна4,9 диена, диол3,диона.
Конверсия ацстата прегна4,9диена,диол3,диона
4.5.3 Биоконверсия а,диацетата прсгна4,9дисна,диол3,
4.5.3.1 Изучение возможности неферментативной ацильнрй миграции ацетильной
группы.
4.5.3.2 Влияние на биоконверсию диацетата.
4.5.3.3 Влияние строения прегна4,9диеновых стероидов на их
конвертируемость.
4.5.3.2 Биоконверсия а, диацетата прегна4,9диен3,диона,
диола в оптимальных условиях.
4.5.4 Конверсия ацетоксипрегна4,9,триен3,диона.
4.5.4.1 Влияние индукции.
4.5.4.2 Влияние биомассы.
4.5.4.3 Локализация стероидэстераз
4.5.4.4 Селективная биоконверсия ацетоксипрегна4,9,триен3,
диона в ацетоксипрегна,4,9,тетрасн3,дион.
4.6 Биотехнологические методы получения стероидов андростанового и
прегнанового ряда
4.6.1 Разработка биотехнологического способа получения тестостерона из
ситостерина
4.6.2 Биотехнологии получения АД, АДД, 9ОНАД.
4.6.3 Биотехнологические методы получения дегидроаналогов стероидов
прегнанового и андростанового ряда.
Заключение.
Выводы.
Список цитированной литературы


Реакция агидроксилирования интенсивно исследовалась в связи с получением триамцинолона эффективного противовоспалительного агента. Использование актинобактерии является наиболее предпочтительным для ее осуществления и получения 1 багидроксистероидов, обладающих высокой ппококортикоидной активностью. Гидроксилазная активность была описана для ряда стрептомицетов . При этом было установлено, что актинобактерии неспецифичны в отношении субстрата наряду с прогестероном, они эффективно гидроксилировали в аположении также тестостерон, дегидротестолактон, дсгидроэииандростсрон ДГЭА, прегненолон, андрост5енЗр,0диол, гидрокси1,3,5эстратриенон и другие стероиды. Было показано, что штамм . Р0, который в сцепке с двумя переносчиками электронов, розеоредоксином и розеоредоксинредуктазой, гидроксилировал экзогенный прогестерон вначале в соответствующий 1 багидроксипрогестерон, а на втором этапе биоконвсрсии в 2р,адигидроксипрогестерои i . Использование реконструированной белковой системы, полученной из очищенных клеточных экстрактов . При выращивании клеток в присутствии прогестерона, в результате прогестсронзавксимой посттрансляционной модификации наблюдалось образование изоформы редоксина, что приводило к изменению соотношения продуктов в сторону уменьшения выхода моногидроксистероида и повышения содержания дигидроксипроизводного i, . Лишь единичные штаммы актинобактерий с низкой активноегью способны проводить гидроксилирование в положении 1а, 2а, , а, , а, . Культуры i i ВКГ1М и АТСС 9 гидроксилировали в положении а АД, почвенные штаммы i . Р и i v 9сскостероиды Войшвилло с соавт. Среди продуктов трансформации эргоста7,диен3ола культурой i i был обнаружен агидроксиэргоста7,диен3он Климашина с соавт. Позиция в традиционно используемых прегнанах защищена карбонильной группой и недоступна для гидроксилирования. Способность актинобактерий к осуществлению гидроксилирования в положениях и неизвестна. Для одного штамма . Других упоминаний о возможности гидроксилирования стеринов или других 3гидроксистероидов в 7м положении актинобактерия. Между тем, интерес к поиску новых штаммов с высокой 7агидроксилазной активностью растет в связи с обнаружением новых биологических активностей 7агидроксистсроидов, применяемых в диагностике и терапии раковых, нейропсихических заболеваний, иммунных расстройств, болезни Альцгеймера, а также в качестве антиглюкокортикоидных агентов , i, . Способность актинобактерий к багидроксилированию не описана, но есть актинобактерии, способные проводить 6i. Как было установлено, в образовании ,ix из 3i5 может принимать участие холестеролоксидаза актинобактерий. При этом процесс сопряжен с окислением 3гидроксила и А5Д4 изомеризацией двойной связи . Способность актинобактерий к гидроксилированию стероидных соединений в положениях , , , интенсивно исследовалась в связи с изучением механизма деградации боковой цепи стеринов. Зкето4енпроизводного в м положении v . Позже было показано, что последовательные реакции гидроксилирования стеринов в вышеуказанных положениях боковой цепи являются этапами ее деградации актинобактериями ii, ii, . Запатентованы несколько штаммов родов , i и , осуществляющих гидроксилирование стероидов в положении . Поиск новых микробных биокатализаторов для гидроксилирования известных и вновь синтезированных стероидных соединений продолжается постоянно в связи с высокой физиологической активностью гидроксипроизводных стероидов. Однако, за последние годы ощутимых успехов в селекции новых актинобактерий с необычной региоили стереохимической активностью достигнуто не было , . Единственным примером может служить обнаружение необычной для микобактерий способности гидроксилировать даммараны в положении штамм i . В . Описаны штаммы актинобактерий, способные вводить двойную связь в положения , , , , 9, стероидной молекулы рис. Рис. Положения стероидной молекулы, в которые актинобактерий вводят двойную связь. Обозначения как на рис. Кстостсроиддсгидрогеназная 3КСД активность описана для штаммов родов i, , ii, , i, , , Ахрем, Титов, , , . Максимальный уровень 3КСД активности был отмечен для ix i ix , , и ii 3 . Красильникова с соавт.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.198, запросов: 145