Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств

Конструирование вакцинных штаммов Francisella tularensis, экспрессирующих протективные антигены Ag85B и ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis, и изучение их иммунобиологических свойств

Автор: Кравченко, Татьяна Борисовна

Шифр специальности: 03.00.07

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2008

Место защиты: Москва

Количество страниц: 153 с. ил.

Артикул: 4073849

Автор: Кравченко, Татьяна Борисовна

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,
СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРИОРИТЕТНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1.2. ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
1.3. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ КАНДИДАТОВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ВАКЦИН
1.3.1. БЕЛКИ КОМПЛЕКСА
1.3.2. БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА 6
1.3.3. И ДРУГИЕ БЕЛКИ
1.4. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ ВАКЦИН
1.4.1. АТТЕНУИРОВАННЫЕ И
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ
1.4.2. СУБЪЕДИНИЧНЫЕ,
КОНЪЮГИРОВАННЫЕ, ДНКВАКЦИНЫ
1.5. ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ
ВАКЦИНАЦИИ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ
1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ
2.2. ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
2.3. ПЛАЗМИДЫ И ПРАЙМЕРЫ
2.4. СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
2.5. ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЕ МАНИПУЛЯЦИИ.
2.6. МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАРГИЙ
2.6.1. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ
2.6.2. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ БЕЖОВ МИКОБАКТЕРИЙ
2.6.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУММАРНОГО АНТИГЕНА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
2.7. МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.7.1. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
2.7.2. ПОЛУЧЕНИЕ МЫШИНЫХ
АНТИСЫВОРОТОК К РЕКОМБИНАНТНЫМ
2.8. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ
2.8.1. РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ В КУЛЬТУРАХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
2.8.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ
ВИРУЛЕНТНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ К ТСЛАЯЕШБ
2.8.3. ДИССЕМИНАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Л ТЬТАКЕМК В ОРГАНИЗМЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
2.8.4. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ
НАСЛЕДОВАНИЯ ПЛАЗМИД
РЕКОМБИНАНТНЫМИ ШТАММАМИ
. I I VIV
2.8.5. ОЦЕНКА УРОВНЯ АНТИТЕЛ К РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКАМ В СЫВОРОТКАХ ИММУНИЗИРОВАННЫХ МЫШЕЙ
2.8.6. РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ
СПЛЕНОЦИТОВ ИММУНИЗИРОВАННЫХ
2.8.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ СИНТЕЗА I
СПЛЕНОЦИТАМИ ИММУНИЗИРОВАННЫХ
2.8.8. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ . I
НА МЫШИНОЙ МОДЕЛИ АЭРОЗОЛЬНОГО
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
2.9. МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ
РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ПЛАЗМИД ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ И АТ6 В КЛЕТКАХ .I
3.1. СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПЛАЗМИДЫ рЕТВ И ЭКСПРЕССИЯ
РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЖА I
3.2. СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПЛАЗМИДЫ рЕТЕ8 И ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЖА ЕБАТб ШБ6 ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ АвВН1Б6 И Е8АТ6Н1Бб, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ КЛЕТКАМИ
4.1. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЖА АСВН
4.2. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Е8АТ6Н
4.3. ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЖАМ А5ВН6 И Е8АТ6Н6 И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА
4.4. ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ПЛАЗМИД И ЭКСПРЕСИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ ГЬАСВ И ГЬА5ВЕ8АТ6 В КЛЕТКАХ Г. ТиГАКЕИЗБ
5.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА РРМС
5.2. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА СЛИТНОГО БЕЖА ГЬАСВ
5.3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА СЛИТНОГО БЕЖА БЬВЕ8АТ
5.4. ЭКСПРЕССИЯ СЛИТНЫХ БЕЖОВ ГЬВ И ГЬВЕ8АТ6 В КЛЕТКАХ Б. ТЛАКЕИЗБ
5.4.1. ЭКСПРЕССИЯ БЕЖА ГЬАСВ
5.4.2. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА РЬА5ВЕ8АТ6
5.5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ХАРАКТЕРИСТИКА
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ . I V И V, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ БЕЖИ И
6.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММАМИ
. I V И V
6.2. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ЭКСПРЕССИИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ ШТАММАМИ
. I I VIV
6.3. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
6.3.1. РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ В КЛЕТКАХ ЛИНИИ 4.
6.3.2. РАЗМНОЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ В ОРГАНИЗМЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
6.4. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ 1 СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
6.4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ АКТИВАЦИИ
ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫМИ
ШТАММАМИ . I
6.4.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ АКТИВАЦИИ
КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА
6.5.ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 7. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Б. ТЦЪАКЕНБ
7.1. ОЦЕНКА ПРОТЕКТИВНОСТИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
Б. ТиЬАЯЕНБГБ ЮР И ЯУР НА МЫШИНОЙ МОДЕЛИ АЭРОЗОЛЬНОГО
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
7.2. ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧТ1ИКОВ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
БСА бычий сывороточный альбумин
ГЗТ гипсрчувствительность замедленного типа
КОЕ колониеобразующая единица i i
ПААГ полиакриламидный гель
ЭДГА этилендиаминтетраацетат
i vi, Центр контроля и предотвращения заболеваний, США
среда Игла в модификации Дульбекко
додецилсульфат натрия
НВНА гепаринсвязывающий гемагглютинин М. i
I интерферонгамма i
I интерлейкин
мультифункциональная каталаза пероксидаза М. i
МНС главный комплекс гистосовместимости
ингибитор протеаз фенилметилсульфинилфторид
очищенный белковый дериват ii i iviv
I7 свободные от специфических патогенов i
фактор неркоза опухоли i
семейство толлподобных рецепторов i
лидерная последовательность белка . i
ОП оптическая плотность раствора
I i Ii среда для культивирования человеческих клеток и клеточных линий
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ


Использование технологии рекомбинантных ДНК, синтетических пептидов, антигенспецифических антител, Тклеток и т. М. i, таких, как белки теплового шока и , Карягина и др. Экспрессия этих белков в гетерологичных векторах и их иммунологическая оценка обеспечила бы возможность идентификации антигенов М. Поскольку активация клеточного иммунитета является основой для формирования противотуберкулезного иммунитета , , Воробьев, Медупицын, Ярилин, vi, , , , соответствующим образом подобранные адьюванты и системы доставки антигенов способствовали бы решению проблем, связанных с недостатками, присущими вакцине . Одним из наиболее перспективных подходов является генетическое конструирование вакцин для защиты от нескольких инфекций одновременно на основе штаммов, полученных путем встраивания в их геном чужеродных антигенов, важных для активации клеточного иммунитета. В качестве вакцинных векторов используют живые аттенуированные штаммы М. Известно, что живая туляремийная вакцина, созданная на основе штамма i i , способна вызывать интенсивную перестройку гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, обеспечивая создание длительного напряженного иммунитета при умеренной реактогенности вакцины Олсуфьев и др. Кроме специфического иммунитета, этот штамм индуцирует кратковременную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов, таких как листерии и легионеллы i е ст. Важно отметить, что клетки вакцинного штамма туляремийного микроба способны размножаться в организме экспериментального животного, иммунизированного живой вакциной , что дает принципиальную возможность повысить иммунный ответ на экспрессируемые протективные антигены М. Вышеперечисленные характеристики штамма . Вопрос о выборе антигенов для конструирования противотуберкулезной вакцины достаточно сложен. Уже изучены иммунологические свойства широкого спектра белков М. Одним из наиболее иммуногенных белков является секретируемый активно размножающимися микобактериями белок белок трехкомпонентного комплекса i . Белки этого комплекса являются ферментами миколилтрансферазами, играющими существенную роль в процессе синтеза клеточной стенки бактерии, однако функция комплекса и его роль в патогенезе туберкулеза до конца не выяснены. Другой белок 6, секретируемый М. Тклеточиый антиген, распознаваемый протективными Тклетками на моделях экспериментального туберкулеза. Данные антигены были выбраны в качестве модельных антигенов для изучения возможности их экспрессии в клетках . Создание штаммов Е. Выделение и очистка антигенов i6 и 6i6 из рекомбинантных штаммов Е. Создание на основе вакцинного штамма . V7 и V8, кодирующих гены слитных белков и 6, и определение уровня их экспрессии. Оценка стабильности рекомбинантных штаммов . V7 и V8 i viv. Оценка уровня активации гуморального и клеточного звеньев иммунитета мышей, иммунизированных штаммами . V7 и V8. Изучение протективности полученных штаммов . V7 и V8 на модели легочной формы экспериментальной туберкулезной инфекции мышей. Получены впервые вакцинные штаммы i , экспрессирующие протективные микобактериальные антигены и 6. Впервые показана протективность сконструированных рекомбинантных штаммов . Созданные рекомбинантные штаммы на основе вакцинного штамма . Микобактериальные рекомбинантные антигены i6 и 6i, экспрессируемые бактериальными клетками . В коллекции живых культур ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии депонированы два авторских штамма . V и . V8, использованные для изучения перспективности использования туляремийной вакцины в качестве бактериального вектора при создании живых противотуберкулезных вакцин федеральный уровень внедрения. Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета. Депонированы в нуклеотидные последовательности двух генов, кодирующих слитные белки и 6, которые экспрессируются вакцинными штаммами . V и . V . Антитела к рекомбинантным белкам i и 6i6 распознают иммунологические эпитопы в природных микобактериальных белках и АТ6.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.251, запросов: 145