Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности

Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности

Автор: Заднова, Светлана Петровна

Шифр специальности: 03.00.07

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2009

Место защиты: Саратов

Количество страниц: 238 с. ил.

Артикул: 4649505

Автор: Заднова, Светлана Петровна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ 6
МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА
1.1. Организация генома возбудителя холеры
1.2. Мобильные генетические элементы V. сИо1егае, содержащие основные гены вирулентности, и их роль в образовании штаммов с новыми свойствами
1.3. Участие внеклеточного экзополисахарида в формировании фе нотнпически измененных форм V сю1егае
1.4. Координированная регуляция экспрессии генов вирулентности
и персистенции у холерного вибриона
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
2.2. Питательные среды и реактивы
2.3. Методы
2.3.1. Культивирование штаммов
2.3.2. Определение продукции растворимой гемагглютининпротеазы, фосфолипазы, гемолизина и подвижности
2.3.3. Изучение синтеза антигена, чувствительности к полимиксину, холерным диагностическим бактериофагам, способности образовывать ацетилметилкарбинол
2.3.4. Реакция самоагглютинации бактерий
2.3.5. Иммуноблоттинг
2.3.6. Определение продукции холерного токсина и гемолизина
2.3.7. Определение вирулентности
2.3.8. Коныогациоипые скрещивания
2.3.9. Анализ плазмидного состава штаммов
2.3 Элсктрофорегическое изучение белкового состава клеток
2.3 Выделение экзополисахарида и количественное определение его содержания
2.3 Тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография
2.3 Электронномикроскопический анализ холерных вибрионов
2.3 Двумерный форез, изофокусировапие, трипешюлиз белков
2.3 Массспектрометр 1я и идентификация белков
2.3 Определение концентрации белка
2.3 Выделение иммуноглобулинов
2.3 Выделение Д1ТК, ДНКДНК гибридизация
2.3 ГЩРтестироваиие и секвенирование
2.3 Методы статистической обработки ГЛАВА
ВЫЯВЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ V. СНОЬЕЯАЕ, СОДЕРЖАЩИХ В ПОПУЛЯЦИИ КЛОПЫ
С КООРДИНИРОВАНО ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ
3.1. Выявление в природных популяциях V эльтор биовара вариантов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции
3.2. Исследование популяционного состава природных штаммов V классического биовара и фенотипический анализ вариантов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции
3.3. Сравнительное изучение генетической организации изогенных вариантов модельного штамма V. Дакка с различными фенотипическими свойствами
ВЫЯВЛЕНИЕ У V КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДНОГО СЛОЯ И ЕГО БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
4.1. Обнаружение на поверхности клеток V экзоиолнсахаридного слоя
4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельного штамма V Дакка
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ I ИЗ ПРОТЕОМОВ ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ V КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА И ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ
5.1. Протеомный анализ изогенных x и
x4 варИантов у Дакка классического биовара
5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов вирулентности и персистенции
5.3. Популяционная изменчивость изогенных x и x вариантов штамма Дакка в условиях i vi и i viv
ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ШТАММОВ V КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ
6.1. Получение штаммов холерного вибриона, содержащих рекомбинантную плазмиду с клонированными генами профагов СТХ и
6.2. Оценка роли глобального регуляторного гена x в повышении экспрессии генов, контролирующих биосинтез , у штаммов, содержащих рекомбинантную плазмиду 5ii
6.3. Влияние профага 1, входящего в состав рекомбинантной плазмиды, на экспрессию гена x


7
4
1
3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ИСХОДНОГО И СОДЕРЖАЩЕГО ПЛАЗМИДУ 5ii ШТАММОВ V. КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА
СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТСИСТЕМЫ
8.1. Получение бесплазмидных штаммовпродуцентов протективных антигенов
8.2. Изучение продукции протективных антигенов штаммамин роду цента ми V. i при малообъемном культивировании
8.3. Получение белкового препарата, содержащего токсинкорегулируемые пили адгезии, и изучение его биохимических свойств
8.4. Получение поликлональных антисывороток, содержащих антитела к токсинкорегулируемым пилям адгезии, и определение их антигенного состава
8.5. Создание лабораторного образца многокомпонентной диагностической иммуиоферментной тестсистемы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
2
3
4
3
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БСА бычий сывороточный альбумн
ВЭЖХ высоэффективиая жидкостная хроматография
ГКПБ Государственная коллекция патогенных бактерий г. Саратов
ФГУЗ РосНИПЧИ Микроб
ДСI додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотреитол
КОЕ колониеобразующие единицы
МГЭ мобильные генетические элементы
мкм микрометр
ОП оптическая плотность
ПААГ полиакриламидный гель
ГИДР полимеразная цепная реакция
РПИГ реакция пассивного иммуннного гемолиза
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ТСХ тонкослойная хроматография
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФВК натриевая соль фосфорновольфрамовой кислоты
АТФсвязывающая кассета система транспорта
2,2 iiii субстрат для выявле
ния пероксидазы
iii не
денатурирующий белки детергент СТ холерный токсин
, 4 разный уровень продукции экзополисахарида
I иммуноферментный анализ с использованием моносиалоганг
лиозидов i
Нар, Нар4 разный уровень синтеза растворимой гемагглютининпротеазы
i штаммы, имеющие мутацию по гистидину
Ii, разный уровень продукции гемолизина
резистентность к канамицину
среда ЛуриаБертани
I время пролетная массспектром етрия с использованием матрицы
, разная степень подвижности клеток
молекулярная масса
II маннозочувствительпые гемагглютинирующис пили адгезии
рассчитанный молекулярный вес
I база данных
i нзоэлектрическая точка
штаммы, имеющие мутацию по пролину
регуляторная система i
стрептомицин
Тсг резистентность к тетрациклину
токсинкорегулируемые пили адгезии
Тох, Тох разный уровень продукции холерного токсина
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров Москва, , а также на совещаниях проблемной комиссии Холера и патогенные для человека вибрионы Координационного научного совета по санитарноэпидемиологической охране территории Российской Федерации РостовнаДону, и ежегодных научных конференциях ФГУЗ РосНИПЧИ Микроб Саратов, . Публикации по теме исследования. По теме диссертации опубликовано научных работ, из них статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 статьи в зарубежных изданиях, 5 патентов на изобретения, тезисов в сборниках международных и Российских конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 8 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 7 ссылок, из них 6 зарубежных и 1 отечественных авторов. Работа иллюстрирована таблицей и рисунками. Холера опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vii . Начиная с г, зарегистрировано семь пандемий этой инфекции. Предполагается, что первые шесть, учитывая тяжесть течения болезни и широкое распространение, были вызваны холерными вибрионами серогруппы классического биовара, однако доподлинно это известно только для 5ой гг. Возбудителем седьмой пандемии, начавшейся в г и продолжающейся по настоящее время, являются вибрионы серогрупны, но другого биовара эльтор Бароян О. В., Ломов Ю. М., Смирнова Н. И., Кутырсв В. В., Москвитина Э. А., iii , . Начиная с г, регистрируются эпидемии холеры, вызванные V ранее неизвестной серогруппы . Высказывается предположение, что вибрионы данной серогруппы возникли в результате горизонтального переноса генов, кодирующих О антиген и полисахаридную капсулу Смирнова П. И., Р. Е.М. Горизонтальный перенос между штаммами V. Присутствие таких штаммов значительно усложняет проведение лечебных мероприятий Подосинникова Л. С. с соавт. Онищенко Г. Г. с соавт. Андрусенко И. Т. с соавт. В настоящее время особый интерес вызывают генетически измененные природные штаммы холерного вибриона с повышенной вирулентностью, совмещающие признаки классического и эльтор биоваров, а также фенотипически измененные формы, сохраняющие вирулентность и более приспособленные к выживанию во внешней среде Смирнова Н. И. с соавт. Такая уникальная способность холерного вибриона к изменчивости связана с особенностями строения его генома, а также с необходимостью существования в разных экологических нишах внешняя среда организм человека. Холерный вибрион, вызывающий тяжелое диарейное заболевание человека, является в тоже время и постоянным обитателем водных экосистем Бухарин О. В. с соавт. Марамович с соавт. I . V . Vi . Для существования в таких разных экологических нишах возбудитель холеры должен обладать набором генов, которые обеспечивают ему выживаемость, как во внешней среде, так и в организме хозяина. При изучении генетической организации было установлено, что холерный вибрион имеет две хромосомы первую большую размером 6 п. С соответственно ,9 и ,7 i М. Секвенирование значительного количества штаммов холерного вибриона позволило составить пангеном, включающий более генов, из которых составляют коровую часть V. На первой хромосоме, помимо эволюционно древних участков, содержащих гены, необходимые для репликации, транскрипции, транслокации, репарации ДНК, биосинтеза клеточной стенки, расположены гены патогенности, значительная часть которых находится на мобильных генетических элементах МГЭ ирофагах, островах патогенности и персистенции рисунок 1. Романова Ю. М., Гшщбург . Н.И. Романова Ю. М. с соавт. На второй хромосоме расположено значительное количество гипотетических и с неустановленной функцией генов, большинство из которых входит в большой остров интегронов 5,3 т. Предполагается, что остров интегронов выполняег функцию главной адаптационной системы у V . На малой хромосоме обнаружены гены, необходимые для роста и жизнеспособности клетки, ответственные за антибиотикоустойчивость, а также участвующие в патогенезе, в том числе кодирующие продукцию гемолизина и липопротеина Ильина Т. С., .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.268, запросов: 145