Изучение экспрессии репликативных белков клостеровирусов in vitro и in vivo и разработка метода детекции вируса деградации плодов черешни

Изучение экспрессии репликативных белков клостеровирусов in vitro и in vivo и разработка метода детекции вируса деградации плодов черешни

Автор: Витушкина, Мария Вячеславовна

Шифр специальности: 03.00.06

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2000

Место защиты: Москва

Количество страниц: 127 с.

Артикул: 2769594

Автор: Витушкина, Мария Вячеславовна

Стоимость: 250 руб.

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Репликативные белки РНКсодержащих
вирусов и их функции
2.1.1.РНКзависимые РНК полимеразы
2.1.2. РНК хсликазм.
2.1.3. Ферменты кепнрования и метилирования.
2.1.4. Репликативные комплексы РНК содержащих
вирусов и их локализация
2.2. Экспрессия репликативных белков 7 РНКсодсржащнх вирусов.
2.2.1. Сегментация вирусных геномов.
2.2.2. Рибосомальный сдвиг рамки считывания.
2.2.3.1. Сдвиг рамки в направлении 1.
2.2.3.2. Сдвиг рамки в направлении 1.
2.2.3. Супрессия термина горшно кодона.
2.2.4. Посттрансляционный процессинг
полннротсинапредшественника
2.2.5.1. Пикорнаподобныс вирусы
2.2.5.2. Семейство флавивирусов.
2.2.5.3. Коронаподобные вирусы.
2.2.5.4. Синбисподобные вирусы растений
2.3. Семейство РНК содержащих клостеровирусов
2.3.1. Общие сведения типичные представители, особенности строения
2.3.2. Экология и диагностика клостеровирусных инфекций
2.3.3. Геномная организация представителей
семейства клостеровирусов.
2.3.4. Комбинация экспрессионных стратегий, используемых
4 в процессе клостсровирусной инфекции.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Ферменты и химические соединении.
3.2. Вирусные изоляты и кДНК клоны
3. 3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы.
3. 4. Олигонуклеотиды.
3.5. Общие молекулярнобиологические мегоды.
3.5.1. Рестрикция.
3.5.2. Электрофорез в агарозном геле и выделение ДНК
3.5.3. Лигирование ДНК
3.5.4. Трансформация бактериальных клеток
нлазмидной ДНК
3.5.5. Выделение нлазмидной ДНК.
3.5.6. Амнлифнцрованне фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР.
3.5.7. Клонирование ПЦР фрагментов
3.5.8. Сплавление одноцепочечных праймеров и клонирование короткого фрагмента дцДНК
3.5.9. Секвенирование ДНК.
3.6. Пепскананализ моноклональных антител к хсликазному XI и метилтрансферазному МТ
доменам вируса желтухи свеклы ВЖС.
3.7. Метод иммунного мечения золотом ИМЗ
тонких срезов растений
3.8. Сайтнанравленный мутагенез по методу Кюнксля
3.9. Транскрипция i vi фреймшифтинг конструкций ВЖС и
трансляция в экстрактах зародышей пшеницы.
ЗЛО. Тестирование конструкций, содержащих ген
бетаглюкуронндазы, в растениях.
3 Метод детекции вируса деградации плодов
черешни ВДНЧ в растениях
4.РЕЗУЛБТАТЫ
4.1. Изучение внутриклеточной локализации продуктов экспрессии репликативного гена 1а ВЖС в зараженных
клетках растений
4.1.1. Картирование эпитопов для моноклональных
антител в ХЕЛ и МТ доменах ВЖС.
4.1.2. Анализ тонких срезов тканей растений, зараженных ВЖС, с помощью иммуноэлекгронной микроскопии с моноклональными антителами к МТ и ХЕЛ доменам
4.2. Тестирование предполагаемого 1 рибосомалыюго сдвига рамки считывания при экспрессии ВЖС в системах
i vi и i viv
4.2.1. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих вероятный сигнал сдвига рамки считывания ВЖС, и трансляция i vi.
4.2.2. Тестирование вероятного сигнала 1 фреймшифтинга у ВЖС и ВДПЧ в системе i viv с использованием инфекционной копии ХВК
4.3. Отработка метода ревер тазной ПЦР для детекции ВДПЧ и характеристика некоторых изолятов, распространенных в Европе.
5. ОБСУЖДЕНИЕ.
5.1. Внутриклеточная локализация репликативных белков ВЖС и анализ состояния эпитопов для моноклональных антител в ХЕЛ и МТ белках
5.2. Тестирование вероятного сигнала сдвига рамки
считывания в системах i vi и i viv
5.3. Новый метод диагностики ВДПЧ и его использование
для различных вирусных изолятов.
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АТ антитело
АТФ аденозинтрифосфат
БСА бычий сывороточный алъбуми
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
МЛ моноклональное антитело
мкг микрограмм
МКЛ микролитер
МТ метилтрансфераза метилтрансферазный домен
нм нанометров
пт нуклеотидный остаток
НТФ пуклеозид трифосфатрв
ОРТ открытая рамка трансляции
ПААГ полиакриламидный гель
ПОЛ полимераза полимеразный домен
Про протеиназа протеиназный домен
ППро папаинподобная протеиназа
ПЦР полимеразная цепная рекция
ПЭ1 полиэтиленгликоль
СБ структурный белок
СБд дупликат структурного белка
т обмин тысяч оборотов в минуту
.V .
сгРНК субгеномнаяРНК .
. ч .
тРНК транспортная РНК
у . ,
V4,
ТВ транспортные белки ТБГ тройной блок генов
ХЕЛ хеликаза хеликазный домен
XI химотрипсинподобная протеиназа
ЭР эндоплазмсипический ретикупум
этилендиамиптетрауксусная кислота
у
килобаза
додещлсульфат натрия СОКРАЩЕНИЯ НАЗВАНИЙ ВИРУСОВ
ВАСЛВ вирус, ассоциированный со скручиванием листьев винограда
ВДПЧ вирус деградации плодов черешни
ВЖКС вирус желтой карликовости свеклы
ВЖМТ вирус желтой мозаики турнепса
ВЖС вирус желтухи свеклы
ВИЖЛ вирус инфекционной желтухи салаталатука
В КА вирус конского артрита ВМГ вирус мышиного гепатита ВМК вирус мозаики костра
ВНМКК вирус некротической мозаики красного клевера
В ОМ вирус огуречной мозаики
ВОММ вирус опухоли молочной железы мышей
ВПТ вирус погремковости табака
ВПЧ вирус пятнистости черники
ВСР вирус саркомы Рауса
ВТМ вирус табачной мозаики
ВТЦ вирус тристецы цитрусовых
ВУЖБ вирус увядания жилок батата
ВЭМК вирус энцефаломиокардита
ВХПО вирус хлоротической пятнистости огурцов
ЧАст1 человеческий астровирус типаI
ХВК Хвирус картофеля
ВВЕДЕНИЕ


Векторы для клонирования и бактериальные штаммы. Олигонуклеотиды. Общие молекулярнобиологические мегоды. Рестрикция. Выделение нлазмидной ДНК. Амнлифнцрованне фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР. Секвенирование ДНК. ВЖС. ЗЛО. РЕЗУЛБТАТЫ
4. ХЕЛ и МТ доменах ВЖС. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих вероятный сигнал сдвига рамки считывания ВЖС, и трансляция i vi. Отработка метода ревер тазной ПЦР для детекции ВДПЧ и характеристика некоторых изолятов, распространенных в Европе. ОБСУЖДЕНИЕ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. V . РНК субгеномнаяРНК . В последние два десятилетия были определены полные последовательности РНК геномов большинства известных вирусных групп, что позволило установить эволюционные связи между ними и сделать компьютерные предсказания функций белков, закодированных в вирусных геномах. В настоящее время основными направлениями молекулярной вирусологии становится исследование механизмов выражения вирусных геномов, а также функциональный и структурный анализ их продуктов. Особый интерес представляет исследование неструктурных белков,
м Л С
которые выполняют функции репликации и транскрипции вирусных геномов. У ряда вирусов с позитивным РНКгеномом синтез активной репликазы осуществляется обычным каноническим считыванием одного гена. Однако, многие РНКсодержащие вирусы используют достаточно сложные механизмы экспрессии репликативных белков, позволяющие синтезировать несколько различных полипептидов и служащие для регуляции экспрессии вирусных репликаз. Семейство vii объединяет около РНКсодержащих вирусов растений, обладающих целым рядом биологических и структурных особенностей, уникальной организацией и стратегией экспрессии генома. Клостеровирусы имеют морфологически полярные сверхгибкие нитевидные вирионы, которые содержат молекулу геномной РНК размером тысяч нуклеотидов. Для экспрессии РНК генома с такой большой кодирующей емкостью представители данной группы используют уникальный набор механизмов i. Так, экспрессия репликативных белков, закодированных в перекрывающихся ОРТ 1а и 1Ь, осуществляется при помощи сложного протеолитического расщепления полипротеинанредшественника v
. Локализация продуктов экспрессии репликативных генов клостеровирусов в зараженных растениях и исследование их структуры может послужить важным шагом для последующего изучения процессов репликации вирусной РНК. РНК геномом. С другой стороны, изучение молекулярной биологии клостеровирусов, которые являются опасными патогенами сельскохозяйственных культур, имеет важное практическое значение, открывая возможности для разработки методов борьбы с вирусными инфекциями и создания современных методов их диагностики. Геном РНКсодержащих вирусов после попадания в клетку прежде всего функционирует как матрица для трансляции. Только после синтеза репликативных белков становятся возможными транскрипция и репликация вирусного генома. В состав репликативных комплексов входят как вирусные белки из которых наиболее универсальным является каталитическая субъединица вирусной РНК полимеразы, так и некоторые белки клеточного происхождения. Основная функция вирусных белков, участвующих в репликации, заключается в матричном
синтезе РНК цепей и связывании нуклеозид трифо. НТФ полимеразный домен ПОЛ. В дополнение к этому, у больших подклассов эукариотических вирусов выявлены активности, участвующие в раскручивании дуплексов и внутримолекулярных вторичных структур РНК хеликазный домен ХЕЛ и кепировании РНК цепей метилтрансферазпый домен МТ Рис. Геномы всех РНКсодержащих вирусов кодируют РНКзависимую РНК полимеразу с универсально консервативным доменом ПОЛ Рис. РНК. Для многих вирусов участие в репликации продуктов генов, кодирующих ПОЛ домен, было показано путем введения мутаций в соответствующие гены инфекционных кДНК Биохимически же каталитическая активность вирусных репликаз была продемонстрирована только для ограниченного числа вирусных белков, таких как субъединица II репликазы фага . ВМК Као . К белок тобамовируса табачной мозаики ВТМ , , 5 белок вируса гепатита С .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.193, запросов: 145