Разработка и усовершенствование методов дифференциальной лабораторной диагностики болезни Тешена

Разработка и усовершенствование методов дифференциальной лабораторной диагностики болезни Тешена

Автор: Власов, Анатолий Николаевич

Шифр специальности: 03.00.06

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2001

Место защиты: Покров

Количество страниц: 134 с. ил

Артикул: 2299635

Автор: Власов, Анатолий Николаевич

Стоимость: 250 руб.

Разработка и усовершенствование методов дифференциальной лабораторной диагностики болезни Тешена  Разработка и усовершенствование методов дифференциальной лабораторной диагностики болезни Тешена 

Оглавление
6.1 Реактивы.
6.1 Исходные водные растворы.
6.1 Оборудование.
6.2. Методы
6.2.1. Получение вируссодержанего материала и
определение его инфекционной активности
6.2.2. Электрофорез в полиакриламидном геле с
додецилсульфатом натрия
6.2.3. Вестсрнблот белков.
6.2.4. Определение концентрации белка
6.2.5. Получение специфических и нормальных антигенов
6.2.6. Получение гибридом
6.2.6.1. Иммунизация мышей.
6.2.6.2. Приготовление культур перитониальных
макрофагов мыши
6.2.6.3. Гибридизация
6.2.7. Скрининг гибридных антителопродуцентов
6.2.8. Определение классов и подклассов
моноклональных иммуноглобулинов
6.2.9. Клонирование гибридных антителопродуцентов
6.2 Криоконсервирование клеток.
6.2 Восстановление гибридом после хранения.
6.2 Получение иммуноасцитических жидкостей.
6.2 Очистка моноклональных антител из асцитических жидкостей
6.2 Конъюгирование моноклональных антител с пероксидазой хрена.
6.2 Определение полипептидной специфичности моноклонатьных антител.
6.2 Лиофилизация.
6.2 Метод конкурентного иммуноферментного анализа
6.2 Сэндвичметод иммуноферментного анализа для выявления антигена.
6.2 Метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА для выявления антител
6.2 Непрямой метод твердофазного
иммуноферментного анализа
6.2 Прямой метод твердофазного иммуноферментного анализа
6.2 Прямой метод гистохимического
иммуноферментного анализа
6.2 Микрометод реакции нейтрализации.
6.2 Реакция диффузионной преципитации
6.3. Резул ыпаты
Оглавление
6.3.1. риготовление антигенсодержащих препаратов
6.3.1.1. Изучение динамики накопления инфекционного вируса и вирусных антигенов в перевиваемой культуре
клеток .
6.3.1.2. Очистка и концентрирование вируса болезни
Тешена .
6.3.1.3. Получение специфической гипериммунной
сыворотки.
6.3.2. Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела, обладающие специфичностью к структурным антигенам вируса болезни Тешена.
6.3.2.1. Иммунизация мышей ВАЬВсдоноров сенсибилизированных Влимфоцитов
6.3.2.2. Гибридизация клеток
6.3.2.3. Разработка непрямого метода твердофазного иммуноферментного анализа для скрининга гибридных антителопроду центов
6.3.2.4. Клонирование гибридных клеток
6.3.3. Изучение свойств полученных моноклональных
антител
6.3.3.1. Определение активности полученных моноклональных антител
6.3.3.2. Определение специфичности полученных моноклональных антител
6.3.3.4. Определение полипептидной специфичности полученных моноклональных антител.
6.3.4. Разработка методов ИФА на основе моноклональных антител для лабораторной диагностики
болезни Тешена
6.3.4.1. Разработка прямого метода твердофазного иммуноферментного анализа для обнаружения антигенов
вируса болезни Тешена.
6.3.4.2. Разработка сэндвичметода ТФ ИФА на основе моноклональных антител для выявления антигенов вируса болезни Тешена
6.3.4.3. Разработка прямого метода ГХ ИФА с использованием МКА для обнаружения антигена вируса
болезни Тешена
6.3.4.4. Разработка метода ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных
антител
6.3.4.5. Разработка метода двухфазного ингибирования
на основе моноклональных антител
Оглавление
6.3.5. Технологическая характеристика клопа гибридных
клеток Т
7. Обсуждение
8. Выводы
9. Практические предложения.
. Список использованной литературы.
. Приложения.
Список сокращений
2. Список сокращений
диаммониевая соль 2.2азинобис 3этилбензтиазолин
сульфоновая кислота
препарат содержащий смесь гипоксантина, аминоптерина и
тимидина входит в состав селективной среды
НТ среда селективная, включающая смесь гипоксантина и
тимидина входит в состав селективной среды
I внутренний сайт связывания с рибосомой
КЬ килобаз тысяча оснований
додсцилсульфат натрия
полиакриламидный гель, включающий додецилсульфат
натрия в буферном растворе электрофорез но Лэммли I I аббревиатура ii мертворожденные,
ii мумифицированные плоды, ii эмбриональная гибель, ii бесплодие
БСА бычий сывороточный альбумин
I ГФРТ гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансферраза
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗФР физиологический раствор с добавлением фосфатного
буферного раствора 74 ЗФРТ ЗФР, содержащий 0. Твин
ЗФРТБСА ЗФР, содержащий 0. Твин и 1 БСА
ИФА иммуноферментный анализ
КББ карбонат бикарбонатный буферный раствор 9.
КДа тысяча Дальтон единица измерения молекулярной массы
КРС крупный рогатый скот
кчс классическая чума свиней
м.м. молекулярная масса
МКА моноклональные антитела
МФА метод флуоресцирующих антител
ПЭГ полиэтиленгликоль
реакция нейтрализации
РНК рибонуклеиновая кислота
РРСС респираторнорепродуктивный синдром свиней
СПФ животные свободные от патогенной микрофлоры
СЭНДВИЧ двойной антительный сэндвич метод ИФА
ТГС трансмиссивный гастроэнтерит свиней
ТФ ИФА твердофазный иммуноферментный анализ
цнс центральная нервная система
цпд цитопатогенное действие
Аннотация
3. Аннотация
Работа посвящена получению гибридом продуцентов моноклональных антител и конструированию на их основе набора препаратов для лабораторной диагностики болезни Тешена на основе иммуноферментного анализа.
В результате работы созданы две иммуноферменгные тестсистемы для обнаружения антигена вируса болезни Тешена и сывороточных антител, синтезируемых в организме переболевших и вакцинированных животных.
Работа выполнена в лаборатории Диагностики ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Росссльхозакадемии ВНИИВВиМ в ходе исследований по тематикам НИР института.
Научнотехническая документация, разработанная по результатам исследований, включает 6 документов, регламентирующих изготовление и использование упомянутых диагностических наборов.
В ходе исследований и по их результатам
разработаны новые методы обнаружения и идентификации антигена вируса болезни Тешена и антител, специфичных к данному вирусу
получено 5 новых линий гибридных клеток, секретирующих моноклональные ан титела к антигенам вируса болезни Тешена
опубликовано 5 научных работ, получены новые данные об антигенной структуре и антигенной гетерогенности вируса болезни Тешена.
введение


Репродуктивные расстройства, также характерные для болезни Тешена, вызывают представители 3, 6 и 8 серотипа. В то же время ряд штаммов вируса болезни Тешена не вызывают характерных для данной болезни признаков, являясь слабовирулентными , 3. Четвертое. Ряд болезней свиней, вызываемых неродственными вирусами, такими как КЧС, болезнь Дуески, РРСС, имеют сходные симптомы. Для лабораторной диагностики болезни Тешена, в настоящее время, используются следующие методы выделение вируса с использованием культур клеток, метод флюоресцирующих антител МФА, реакция нейтрализации и твердофазный иммуноферментный анализ ТФ ИФА на основе поликлональных сывороточных антител для обнаружения и идентификации антигенов возбудителя. Для обнаружения в сыворотке крови животных антител, специфичных к вирусу болезни Тешена, применяют реакцию нейтрализации на культуре клеток и непрямой МФА. Использование в указанных методах поликлональных сывороточных антител не позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от близкородственных энтеровирусов. В настоящее время для изучения свойств возбудителей различных заболеваний нашли широкое применение методы, связанные с использованием моноклональных антител МКА. Разработанный в г. МКА сделал возможным получение биохимически гомогенных, специфичных к одной определенной антигенной детерминанте, стабильных по специфичности и авидности иммунных реагентов ,4. Такие свойства МКА позволяют использовать их для повышения чувствительности и специфичности серологических реакций и разработки высокоэффективных методов молекулярного анализа. МКА новых методов лабораторной диагностики вирусных инфекций. На основании вышеизложенного представляется целесообразным проведение в России работы по получению МКА, специфичных к антигенам вируса болезни Тешена, для разработки на их основе средств и методов диагностики болезни Тешена. Целью нашей работы являлась разработка диагностического набора препаратов на основе моноклональных антител, для обнаружения вирусных антигенов и специфичных к ним антител, пригодного для использования в схеме лабораторной диагностики данной болезни. Тешена пригодных для иммунизации мышейдоноров сенсибилизированных Влимфоцитов и скрининга гибридных антителопродуцентов. Тешена на основе иммуноферментного анализа. Тешена. Тешена и энтеровирусов свиней. Тешена и специфичных к нему антител. Тешена. Введение
4. МКА, специфичные к структурным белкам капсида вируса болезни Тешена. Установлено, что антигенные детерминанты вируса болезни Тешена, распознаваемые моноклональными антителами клона Т4, присутствуют па соответствующих белках всех изученных штаммов данного вируса. Антигенные детерминанты, распознаваемые моноклональными антителами указанного клона, отсутствуют у всех изученных нами штаммов энтеровирусов свиней. На основе моноклональных антител клона Т4 разработаны прямой гистохимический метод ИФА и сэндвичметод ТФ ИФА для обнаружения и идентификации антигена вируса болезни Тешена. Па основе моноклональных антител клона Т4 разработан метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА для обнаружения и идентификации антител, обладающих специфичностью к вирусу болезни Тешена. С помощью МКА показано наличие у вируса болезни Тешена уникальных антигенных детерминант, отличающих его от энтеровирусов свиней других серотипов. Депонированы в коллекции гибридных культур ВНИИВВиМ 5 клонов гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к вирусу болезни Тешепа. Создан абор препаратов для диагностики болезни Тешена гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител, позволяющий выявлять антиген вируса болезни Тешена в клетках инфицированной культуры и дифференцировать его от других энтеровирусов свиней. Создан Набор препаратов для диагностики болезни Тешена твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител, позволяющий выявлять антиген вируса болезни Тешена в головном мозге больных свиней. А также набор позволяет выявлять специфичные к вирусу болезни Тешена антитела в сыворотках крови больных, переболевших, иммунизированных и вакцинированных животных.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.327, запросов: 144