Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)

Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)

Автор: Панасенко, Олеся Олеговна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Москва

Количество страниц: 165 с. ил.

Артикул: 2623342

Автор: Панасенко, Олеся Олеговна

Стоимость: 250 руб.

Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)  Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25) 

1. Малые белки теплового шока
1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока
1.2. Строение мономеров малых белков теплового шока.
1.3. Механизм сборки олигомеров малых белков теплового шока.
1.4. Строение олигомеров малых белков теплового шока
1.5. Фосфорилированнс малых белков теплового шока.
1.6. Шапсронная активность малых белков теплового шока
2. Актин
2. 1. Структурная организация молекулы актнна.
2. 2. Полимеризация актина с образованием актиповых филаментов
3. Участие в формировании цитоскслета
3.1. Внугриклеточиая локализация и взаимодействие с цнтоскслстом
3.2. Влияние па полимеризацию актина.
3.3. Возможное участие в регуляции мышечного сокращения
Материалы и методы.
1. Препаративные методы
1.1. Приготовление компетентных клеток
1.2. Экспрессия рекомбинантного и его точечных мугантов.
1.3. Выделение рекомбинантного и его точечных мутантов из клеток Е. i.
1.4. Выделение актина из ацеюнового порошка скслегных мышц кролика
2. Методы, использованные при исследование структуры и свойств
2.1. Определение содержания в тканях утки.
2.2. Определение олигомерной структуры методом гсльфильтрации.
2.3. Исследование свойств методом ионообменной хроматографии
2.4. Исследование гидрофобных свойств с номошыо флуоресцентного зонда i.
2.4.1. Определение параметров связывания i с белком
2.4.2. Флуоресцентный резонансный перенос энергии от остатков триптофана на i.
2.5. Определение шанерошюй активности .
2.5.1. Определение шапероипой активности с алакгальбумином
2.5.2. Определение шапероипой активности с АДГ.
3. Методы, использованные при исследовании структуры и свойств актина.
3.1. Определение натнвпостн актина
3.2. Взаимодействие актина с
3.3. Ограниченный протсолиз актина
3.4. Исследование агрегации нативного и денатурированною актина методом гсльфильтрации
3.5. Исследование агрегации актина методом светорассеяния.
4. Методы, использованные для изучения взаимодействия с актином.
4.1. Исследование влияния на полимеризацию актина методом центрифугирования.
4.2. Исследование влияния на агрегацию актина методом центрифугирования
5. Некоторые аналитические методы, использованные в работе
5.1. Определение концентрации белка.
5.1.1. Спектрофотометричсский метод
5.1.2. Метод Бредфорд
5.1.3. Метод Шафнера и Вайсмана
5.2. Электрофорегичсскис методи
5.2.1. Электрофорез в ПЛАГ в присутствие ДС.
5.2.2. Нативный электрофорез по методу Шаггера и соавт.
5.2.3. Изоэлсктрофокусированис.
5.3. Иммуноблоттинг
Результаты исследования.
1. Структура и некоторые свойства .
1.1. Определение содержания в различных тканях птиц
1.2. Первичная структура из тканей птиц
1.3. Сравнение некоторых свойств рекомбинантного и , выделенного из разных тканей птиц
1.4. Исследование олигомерной структуры
1.4.1. Влияние точечных мутаций на олигомерную структуру .
1.4.2. Исследование олигомерного состояния и его мутантов методом нативного электрофореза
1.4.3. Влияние концентрации на его олигомерное состояние.
1.4.4. Влияние среды на олигомерное состояние .
1.5. Влияние точечных мутаций на поверхностный заряд олигомеров
1.6. Образование гетероолигомерных комплексов
1.7. Исследование гидрофобных свойств с помощью флуоресцентного зонда i.
1.7.1. Определение параметров связывания i с белком
1.7.2. Флуоресцентный резонансный перенос энергии от остатков триптофана на i.
1.8. Шаперонная активность .
1.8.1. Влияние и акрнсталлииа на агрегацию алактальбумииа
1.8.1.1. Сравнение шанеронной активности дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилированнс, и акристаллниа
1.8.1.2. Исследование влияния среды на шапероиную активность
1.8.2. Влияние и акристаллипа на агрегацию алкогольдегидрогеназы из дрожжей
1.8.2.1. Сравнение шаперопной активности дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилнрование, и акристаллина
1.8.2.2. Исследование влияния i среды на шаперонную активность
2. Стру ктура и некоторые свойства актина.
2.1. Изменение триптофановой флуоресценции актина при тепловой денатурации.
2.2. Влияние термобработки на агрегацию актина
2.3. Влияние термобработки на гидрофобные свойства акт ина
2.4. Ораничснньй протсолиз актина
2.5. Исследование агрегации актина методом светорассеяния
3. Взаимодействие с акином.
3.1. Влияние на полимеризацию актина.
3.2. Влияние на арегацию термически денатурированного акгина
Обсуждение
1. Структу ра и некоторые свойст ва .
2. Структу ра и некоторые свойства актина. Взаимодействие с актином
Список литсратры
Список сокращений
актии фибриллярный актин
актин глобулярный актин
К константа диссоциации
ЛЛ акрилам ид
ЛДГ азкогольдегидрогеназа
Бистрис бис2гидроксиэтиламинотрнсгидроксиметилметан
БСЛ бычий сывороточный альбумин
ДЛБ 3,3диаминобсизиднп
ДНК дезокирибонуклеиновая кислота
ДС долепил сульфат натрия
МБЛ мстилснбисакрилачид
ИЛЛГ полиакриламидный гель
I1 протсинкиназа или зависмая протсиикиназа
1КЛ протсиикиназа Л или сАМРзависимая протсинкиназа
ПКС протсинкиназа С или фосфолипид зависимая протсинкиназа
ПСА персульфат аммония
ТЕМЕД Ы,Ы,Ы,Н,тстрамстилзтилсидиами
Трис трисгндроксимстилмстиламин
Трицин Мтрисгидроксимстилмстилглицин
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФМСФ фснилметилсульфонилфторид
ЭГТА этилен гл и кол ьтстраацстат
ЭДТА этил с диам и тетраацетат
ЭПР электронный парамагнитный резонанс
аденозин дифосфат
1анилиио8афталии1сульфоновая кислота
АТР аденозинтрифосфат
i 4,4,дианнлин1,Гдинафтали5,5дисульфоновая кислота
сАМР циклический аденозин монофосфат
1 мутант с заменой i 5 на остаток
2 мутант с заменой 7 и i на остатки
3 мутант с заменой , 7x и i на остатки
x iv i внеклеточная киназа
i i киназа фокальных контактов
гуанозинтрифосфат
2гилроксиэтил ииперазипЫ2этансульфоиовая кислота
i белки теплового шока
малый белок теплового шока птиц с молекулярной массой кДа
i i концевая киназа
МАРК iiv i i митогенактнвируемая протеи ii киназа
МЛРКАР киназа iiv i i протсинкиназа, активируемая МАРК
МЕКК i киназа МКК
i i i ii i белкиактиваторы протсипкиназы, характерной для скелетных мышц с миоюнической дистрофией
мкк МАРК i киназа МАРК
рЗВМАРК р iiv i i р мнтогенактивируемая прогеинкиназа
РАК iv i киназа активируемая белком р
I3 киназа фосфоинозитил3киназа
i самокомплимснтарный мотив
i малые белки теплового шока
мМ трисНС1, 7,5, 0 мМ 0,1
i фактора некроза опухати
Введение


Вторичная структура концсвого домена малых белков теплового шока представлена тремя короткими аспиралями и значительным количеством неупорядоченных структур 2. В Скониеной части малых белков тепловою шока располагается икристаллиновын домен, состоящий из 0 аминокислотных остатков. В огличис от концевого домена эта последовательность высоко консервативна между разными млекопитающих гомология достигает 2. Вкристаллин
Нвр
Нч,
моутюнриккйтьсргурйкг. МОХАТННРЯТВВРГТРШ Р1. П0РГСЕШ. ЗЭ1. МТЕКАУРК. АСгМОРЕВОКУРН5Р1. ПОЛЕС1. РВ1. РЕЕЛЗС1. СРОРР1Г1. Вкрист аллил РЗП. ВАРЯЕЭТС1. ХЯАРБУА1. РУРТРРСНЕЗУ1. ЭУКНЕЗРЕЕ1 АУКУУБЕНУЕУНАЯНЕЕРРЕНСР. Нр АУрл1. ЕРНАт1РАОУОР1ТГТ1. ОСУ1. ТУМСРВК0 УЗСРЕ. ЕГПЯРУРТ. РРЗПРЛЛУТЗАХ. СХТККУТЕРРгОРТОУЗЗЗЬЗРЕОТЬТУИАРМРКЬА3МЕШХ,ЗКА0ХДЗСРЕААККТААК 5 СХТККУТХ. РРаУРРЛ. УЗЗЗЬ5РЕС,ТУЕАР1. ЗСКЕУККП1ЬРЕРАКГОЕУКАС1. ТУ1. РЗП. ЯЛНГОТГЛ. ЯАР8 УЛ1,РУРТРРСНЕЗУ1. МННВНН1НЛехто . РАЕЗКА1Л1К. ССБЗЕТААЕАЫАКУРИККГРКАНУХХУРХ,РОУККЦКУХУЬУКРС1. Рис. Схема строения и первичная структура . А. Схема строения яйкр. Обозначены Мконцевой и Сконцевой оскристалл и новый домены и вариабельная Сконцевая последовательность. Ьуквой Р обозначены участки фосфорнлирования. Б. Сравнение первичной структуры малых белков теплового шока поданным базы ЗнзяяРго по данным 6. Л Р9 и схВкристаллины человека Р1 1ьр человека Й5р человека Р2 Ььр мыши Р2 Й5р,9 из пшеницы Р0 Ьяр,5 из М. ИИ . Внизу обозначены аспирали и рслои Й5р,5 из М. ЬИ. Пунктирной линией обозначен акристаллиновый домен 1ьр,5 из М. ИИ. На рисунке выделены цветом остатки ссрина 8, иолвергаютиеся фосфорилированию красным, ОРРмотивы в концевом домене малых белков теплового шока желтым, БСМ и БСМ2 мотивы темносиним, консервативная последовательность в Сконцсвом участке зеленым. I Га самом Сконце молекулы располагается короткая, вариабельная последовательность, которая по данным ЯМР спектроскопии обладает высокой подвижностью и экспонирована из гидрофобного Скопаевого домена в растворитель 1 5. В этой последовательности удастся выявить короткую аспираль и Рс кладку. Таким образом, вторичная структура яЬяр представлена преимущественно рскладками, в то время как доля аспиралсй относительно мала . Действительно, согласно расчетам в молекуле йр и аВкристаллине мыши на долю ртяжей приходится , тогда как па долю аспиралсй от 2 до структур, . До настоящего времени в литературе нет данных о третичной структуре изолированных мономеров малых белков теплового шока. Эго связано с тем, что большая част малых белков теплового шока существует в виде олигомеров, что делает практически невозможным выделение и кристаллизацию мономеров этих белков. Да. В условиях стресса размер этих комплексов может возрастать до кДа. Олигомеры яяр млекопитающих обладают очень динамичной структурой, поэтому закристаллизовать и исследовать их структуру с помощью реитгсиоструктурного анализа ло сих пор не удавалось. Сведения об олигомерной структуре эйзр получены в основном из данных рентгеноструктурного анализа йр,5 из термофильной археи МеОшпоспсст уаппазс 2 и р ,9 из пшеницы 6. Олигомерный комплекс 1гр,5 из М. ИН имеет массу около 0 кДа, состоит из субъединиц и представляет собой сферу с внешним диаметром, равным 0 Л. Внутри этой сферы имеется полость диаметром А. Олигомер Ьр,5 обладает октаэдрической симметрией, и на его поверхности находятся восемь треугольных и шесть квадратных отверстии рис. В 2. Олигомерный комплекс . Г 6. Данные рентеноструктуриого анализа свидетельствуют в пользу того, что наименьшей структурной единицей в олигомере ькр является димер . Рис. Структура олигомеЮн малых белкой теплового шока на примере 1чр,5 из М. Ьчр. Х6. А. Вторичная структура димера Ь5р ,5. Молипептидные цепи двух мономеров обозначены синими и черными линиями, рскладки, вовлеченные в образование четырех Рслоев, обозначены разными цветами. Ь. Взаимодействие четырех димеров 6,5 М. ИИ. Каждый из димеров обозначен своим цветом. В. Олигомерная структура Нр. М ппазсИИ. Каждый тетрамер обозначен различным цветом. Г. Олигомерная структура Нр . Каждый димер обозначен различным цветом.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.284, запросов: 145