Структурно-функциональные характеристики взаимодействия церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой

Структурно-функциональные характеристики взаимодействия церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой

Автор: Соколов, Алексей Викторович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 148 с. 25 ил.

Артикул: 4307362

Автор: Соколов, Алексей Викторович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
1.1. Церулоплазмин
1.1.1. Физикохимические свойства и структура церулоплазмина
1.1.2. Ионы меди и строение активного центра церулоплазмина.
1.1.3. Организация и экспрессия гена церулоплазмина.
1.1.4. Биологические функции церулоплазмина.
1.1.4.1. Участие церулоплазмина в метаболизме меди
1.1.4.2. Участие церулоплазмина в метаболизме железа
1.1.4.3. Ферментативная активность церулоплазмина антиоксидант и ирооксидант.
1.1.4.4. Церулоплазмин в центральной нервной системе
1.1.4.5. Ингибирование церулоплазмином ЫОзависимого клеточного ответа
1.1.4.6. Белокбелковые комплексы церулоплазмина
1.1.5. Наследственные заболевания, связанные с церулоплазмином
1.1.6. Диагностическое и фармакологическое применение церулоплазмина
1.2. Лактоферрин
1.2.1. Физикохимические свойства и структура лактоферрина
1.2.2. Организация и экспрессия гена лактоферрина.
1.2.3. Синтез лактоферрина в организме
1.2.4. Биологические функции лактоферрина.
1.2.4.1. Участие лакгоферрина в метаболизме железа
1.2.4.2. Ферментативные акгивности лактоферрина.
1.2.4.3. Взаимодействие лакгоферрина с полианионными молекулами.
1.2.4.4. Транскрипционная активность лакгоферрина.
1.2.4.5. Иммуномодулирующие свойства лактоферрина.
1.2.4.6. Лактоферрин как ростовой фактор
1.2.4.7. Белокбелковые взаимодействия лактоферрина.
1.3. Миелопероксидаза.
1.3.1. Физикохимические свойства и строение миелопероксидазы.
1.3.2. Строение активного центра и каталитический цикл миелопероксидазы
1.3.3. Ор1Днизация и экспрессия гена миелопероксидазы.
1.3.4. Биологические функции миелопероксидазы.
1.3.4.1. Антимикробная акгивность миелопероксидазы
1.3.4.2. Миелопероксидаза и патология.
1.3.4.3. Ингибирование миелопероксидазой активности тригггазы.
1.3.4.4. Белокбелковые взаимодействия миелопероксидазы.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Синтез хроматографических смол и проведение хроматографий
2.1.1. Иммобилизация соединений, содержащих БЛЬгруппу, на ВгСЫактивированной Сефарозе.
2.1.2. Получение аминоэтилАЕАгарозы.
2.1.3. Гельфильтрация на i.
2.1.4. Аффинная хроматография на ЦПСефарозе.
2.1.5. Аффинная хроматография протеолизованного ЦП на
ЛФ и МПОСефарозе.
2.1.6. Измерение константы диссоциации комплекса ЦПЛФ.
2.2. Сиектрофотометрические измерения
2.3. Методы определения активности ферментов.
2.3.1. Определение 7фенилендиаминоксидазной активности церулоплазмина
2.3.2. Определение ферроксидазной активности церулоплазмина
2.3.3. Изучение кинетики ферроксидазной реакции церулоплазмина.
2.3.4. Изучение встраивания в апотрансферрины железа окисленного церулоплазмином в процессе ферроксидазной реакции
2.3.5. Изучение кинетики оксидазной активности церулоплазмина в отношении одианизидина
2.3.6. Изучение кинетики оксидазной активности церулоплазмина в отношении 7фенилендиамина
2.3.7. Изучение кинетики оксидазной активности церулоплазмина в отношении дигидроксифенилаланина.
2.3.8. Определение пероксидазной активности миелопероксидазы.
2.3.9. Определение хлорирующей активности миелопероксидазы.
2.3 Определение активности эласгазы и протеиназы 3.
2.3 Определение активности катепсина .
2.4. Получение белковых препаратов.
2.4.1. Получение лактоферрина молока.
2.4.2.1. Получение церулоплазмина крови
2.4.2.2. Выделение церулоплазмина из крови на АЕАгарозе.
2.4.3. Выделение миелопероксидазы из экстракта лейкоцитов
2.4.4. Выделение эласгазы из экстракта лейкоцитов
2.4.5. Выделение комплекса ЦПЛФ из грудного молока и слезной жидкости.
2.5. Подготовка белковых образцов к анализу
2.5.1. Подготовка белков к массспекзрометрическому анализу фрагментов трипсинолиза.
2.5.2. Ограниченный протеолиз белков.
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.6.1. Электрофорез в щелочной системе.
2.6.1.1 Выявление оксидазной активности ЦП в ПААГ
2.6.2. Электрофорез в кислой системе.
2.6.2.1. Выявление пероксидазной активности МПО в ААГ
2.6.3. Электрофорез в кислой системе в присутствии мочевины
2.6.4. Элекфофорез в щелочной системе в присутствии
2.6.5. Электрофорез в прису тствии в высокомолярной iбуферной системе
2.7. Иммунохимические и иммуноэлектрофорстические методы.
2.7.1. Иммунизация кроликов белковыми антигенами.
2.7.2. Двойная радиальная иммунодиффузия.
2.7.3. Выделение фракции I из антисыворотки кролика
2.7.4. Ракетный иммуноэлектрофорез.
2.7.5. Перекрестный иммуноэлектрофорез.
2.7.5.1. Выявление пероксидазной активности МПО в иммунных преципитатах.
2.7.6. Вестернблоттинг
2.8. Моделирование комплекса ЦПМПО i viv
2.9. Обработка экспериментальных данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с ЦП i vi
3.2. Взаимодействие ЦП с ЛФ и МПО i vi
3.2.1. Формирование комплексов при электрофорезе
3.2.2. Иммуноэлеюрофоретивеские свойства комплексов.
3.2.3. Гельфильтрация комплексов.
3.2.4. Условия диссоциации комплексов.
3.2.5. Получение межвидовых комплексов
3.2.6. Взаимодействие фрагментов ЦП с ЛФ и МПО
3.3. Влияние комплексообразования на ферментативные свойства компонентов
3.3.1. Влияние ЛФ и МГГО на ферроксидазную акгивность ДП.
3.3.2. Влияние ЛФ и МПО на оксидазную активность ЦП в отношении
одиаиизидина
3.3.3. Влияние ЛФ и МПО на оксидазную активность ЦП в отношении 7фснилендиамина.
3.3.4. Влияние ЛФ и МПО на оксидазную активность ЦП в отношении дигидроксифенилаланина.
3.3.5. Определение константы диссоциации комплекса ЦПЛФ
3.3.6. Влияние ЦП на ферментативную активность МПО
3.3.7. Оптимизация условий кристаллизации комплекса ЦГМПО и рентгенострукгурный анализ кристаллов.
3.3.8. Защитное действие МПО от протеолиза ЦП сериновыми протеиназами
3.4. Обнаружение комплексов ЦП с ЛФ и МПО i viv.
3.5. Заключение.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Список сокращений ЛБТС 2,2диазинобис3этилбензотриазолин6сульфонат натрия
а.о. аминокислотный остаток АС антисыйоротка АТ антитела ЛГ1С липополисахарид ЛСД диэтиламид лизергиновой кислоты ЛФ лактоферрин МБА М,Мметиленбисакриламид МПО мислопероксидаза НЦФ нитроцеллюлозный фильтр ПААГполиакриламидный гель ТЕМЕД ,,, тетраметилэтилендиамин ТФ трансферрин сыворотки крови
Феррозин пиридил5,6бис4фенилсульфоновая кта1,2,4триазин ФМСФ фен ил метилсульфонилфторид ЦНС центральная нервная система ЦП церулоплазмин
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
ЭФ электрофорез АсОН уксусная кислота АЕ аминоэтил
vi i ii этиловый эфир ЫбензоилБтирозина карбокси мстил диэтил аминоэтил делеция
дигидроксифенилаланин глутатион
I глицеролфосфоинозидный якорь
I иммуноглобулины i инсерция I1 ферропортин 1 константа активации константа диссоциации К константа ингибирования КП1 константа Михаэлиса
I фактор, ингибирующий миграцию макрофагов нитрофснол1ВОСА1а Оу супероксиданиониый радикал оииодиан изидин
РАС АР полипептид гипоталамуса, активирующий аденилатциклазу
i
ларяфенилсндиамин
четвертичный аминоэтил
до деци л сульфат натрия
i i
I i трисоксиметиламинометан
V скорость реакции
Vx максимальная скорость реакции
ВВЕДЕНИЕ
.когда доходишь до определения даже не мал, масштабы теряются даже не мал это все равно что чудовищно велик, а приближение к атому оказывалось, без преувеличения, действительно роковым, ибо в миг последнего деления и дробления материальной частицы внезапно раскрывался астрономический космос Т. Манн
Актуальность


Кристаллографические исследования комплекса ЦПМПО проведены к. В.Р. Самыгиной Институт Кристаллографии РАН, г. Москва на станции синхротронного излучения ВУ6, ОЕБУ при сотрудничестве Г. Германия. Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Список цитируемой литературы, включающий отечественных и 0 иностранных источников, а также Приложение. Диссертация изложена на 3 стр. Результаты представлены в 5 таблицах и иллюстрированы рисунками. Автор глубоко признателен руководителю диссертационной работы профессору Вадиму Борисовичу Васильеву. Автор выражает благодарность за всестороннюю помощь своим родителям Нине Владимировне и Виктору Николаевичу руководителям Елене Тихоновне Захаровой, Михаилу Михайловичу Шавловскому и Марии Олеговне Нулиной, преподавателям Валентине Васильевне Денежкиной, Татьяне Владимировне Туз, Владимиру Николаевичу Кокрякову, Александру Витальевичу Полевщикову, Галине Петровне Диосе, Александру Альфредовичу Мюльбергу и Георгию Георгиевичу Вольскому коллегам Михаилу Николаевичу Берлову, Ольге Леонидовне Руновой, Валерии Ролановне Самыгиной, Ирине Ивановне Власовой, Олегу Михайловичу Панасенко, Юрию Александровичу Эйсмонту, Владимиру Валерьевичу Егорову, Наталье Андреевне Грудининой, Николаю Ивановичу Колодкину, Георгию Николаевичу Волгину и Юрию Александровичу Спесивцеву студентам Кире Викторовне Агеевой, Александре Сергеевне Суворовой, Екатерине Евгеньевне Костюхиной, Марату Игоревичу Айрапетову и Андрею Владимировичу Толмачеву. Церулоплазмин ЦП был впервые выделен и описан шведскими учеными Холмбергом и Лауреллом в году , . Спустя несколько лет он был подробно охарактеризован и получил свое название, означающее небесноголубой белок плазмы , , . ЦП медьсодержащий гликопротеид, относящийся к сьглобулиновой фракции плазмы крови человека. С аминокислотными остатками а. ЦП прочно связано 6 ионов меди iv аЦ . ЦП человека состоит из одной полипептидной цепи , , . Она, как показало определение первичной структуры белка, состоит из а. Однако, традиционно, каждый из купредоксиновых доменов разделяют на два таким образом, молекула ЦП состоит из 6 гомологичных доменов Рис. Суммарная молекулярная масса М а. ЦП Да, а М молекулы в целом, с учетом углеводных цепей и ионов меди, около 2 кДа. По данным исследования кристаллов ЛЦП кДа ii . В первом домене молекулы ЦП расположен сайт для связывания иона Са2 К9, 4, 7, 8, который гомологичен сайту для Са в факторе свертывания крови V. Их роль, вероятно, заключается в поддержании структуры трех протуберанцев, выступающих на вершине пирамидальной молекулы ЦП . При хроматографии на гидроксилапатите разделяются две изоформы ЦП , . II три олигосахаридные цепи. Олигосахариды присоединены к белковой цепи Ыгликозидной связью с остатками аспарагина 9, 9 только в изоформе I, 8 и 3 ТакаИазЫ, . С молекулой ЦП связаны двухантенные и трехантенные олигосахаридные цепи УатаБЬпа е1 а1. Рис. Модели холоЦП А и апоЦП Б V . В изоформе II домены выделены I и 2 оранжевым, 3 и 4 желтым, 5 и б синим. В, Г. Схема распределения ионов меди I синие а, Ь, с, II голубой и III типа желтые между доменами в проекции на молекулу ЦП В v . Г . Углеводные цепи обозначены зигзагами, в изоформе II отсутствует углеводная цепь в конце 2 домена. Исследованные к настоящему моменту ЦП разных видов позвоночных незначительно различаются по М и содержанию меди Таб. Источник Таблицы 1. Таблица 1. Обезьяна 2 6 Шапошников и др. Бык 5 6 . Крыса 2 6 Захарова и др. Овца 5 6 . Гусь 1 6 ii . Черепаха 5 5 i . Лошадь 5 6 . Дельфин 2 6 i i i . Мышь 1 6 Лившиц др. Кролик 5 5 i . Верблюд 0 6 i . Полипептидная цепь ЦП человека легко фрагментируется в реакции ограниченного протеолиза , , , причем ее разрыв происходит по пептидным связям между гомологичными доменами, что приводит к образованию фрагментов со сходными М Рис. С помощью сайтнаправленного мутагенеза по К7, 1 и 1 был получен ЦП человека, устойчивый к протеолизу ii .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.300, запросов: 145