Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток

Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток

Автор: Копылов, Артур Тигранович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 161 с.

Артикул: 4360727

Автор: Копылов, Артур Тигранович

Стоимость: 250 руб.

1 Определение и постановка цели и задач проводимой работы.
Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах
2 Литературный обзор по современным метолам и достижениям в
относительной и абсолютной количественной протеомике
2.1 Краткая история развития количественной протеомики, важность и
области применения количественного анализа медицина, фармакология, криминалистика, наркология, диагностика заболеваний
2.2 Химические методы изотопного мечения в количественной протеомики
2.2.1 I сайтспецифическое мечение по цистеинам
2.2.2 I метионин и цистеин специфичное мечениеТеория масс
спектрометрическою количественного анализа, его возможности, достоинства и недостатки
2.2.3 Гуанидирование лизинспецифичное мечение
2.2.4 Изотопное мечение по лизину и свободным 2
2.2.5 Твердофазное изотопное мечение лейцин I
2.3 Ферментативное Сконцевое 1б мечение белков.
2.4 Изотопное мечение белков в культуре клеток I
2.4.1 I с изотопными аминокислотами в культуральной среде
. 2.4.2 I с изотопными атомами в культуральной среде
2.4.3 II АС с изотопными атомами 1С,3С в культуральной среде
2.5 Метод количественной оценки на уровне . ii изобарное
аминомечение
2.6 Количественная масс спектрометрическая оценка посттрансляционных
модификаций белков
2.6.1 Фосфопротеомика
2.6.1.1 Iметаллоаффинная хроматография
2.6.1.2 Метод без использования изотопной метки. Мультипротеазный подход
2.6.2 Гликопротсомика
2.6.2.1 Дериватизация и изотопное мечение з0аргинином
2.6.2.2 Твердофазное изотопное мечение I
2.6.2.3 Метод без использования изотопной метки. Изучение О
сульфатированных форм серина и треонина
2.6.2.4 Фронтальная аффинная хроматография РАС
2.7 Абсолютый количественный анализ белков и фосфопротеинов методом
тандемной массспектрометрии
2.8 Заключение
3 Материалы и методы
3.1 Выбор чистых препаратов белков для количественного анализа
3.1.1 Критерии отбора белков
Подготовка чистых препаратов индивидуальных белков для масс
3.1.2 спектрометрического анализа
Выбор концентрационного диапазона для массспектрометрического
3.1.2.1 анализа
Проведение модифицированного гидролитического расщепления белков
3.1.2.2 трипсином в растворе
Условия стабильности массспектрометрического анализа для построения
3.1.2.3 калибровочной кривой
Подготовка смеси модельных белков для массспектрометрического
3.1.3 анализа. Выбор молярных соотношений белков и числа различных белков в смеси
Подготовка препарата с включением Сконцевого зМ5,бСаргинина
3.1.4.1 Химическое описание синтетических пептидов
3.1.4.2 Подготовка препарата пептидов и анализ контаминации примесными пептидами
3.1.4.3 Очистка пептидов после протеолиза на колонке с обращенной фазой и анализ чистоты препарата на МА1.Т0Е
Подготовка препарата пептидов для массспектрометрического анализа
Выбор приборной базы ЮЕЗМБМб и ЕЦТОР
3.1.4.4.
3.1.4.4.2 Верификация пептидов и определение концентрационных диапазонов верифицированных пептидов
3.1.5 Мечение белков тяжелыми атомами кислорода О
3.2 Выбор микросом как объекта исследований и критерии отбора
Подготовка проб микросом
3.2.2 Химическая модификация белков в пробах микросом
3.2.3 Осаждение белков и подготовка к хроматографической очистке на
колонке с обращенной фазой
3.2.4 Предварительное фракционирование белков на колонке тРРС с
обращенной фазой, как элемент трехмерной хроматографии
3.2.5 Модифицированные условия проведения гидролитического
расщепления белков трипсином
3.2.6 Подготовка проб для массспектрометрического анализа
3.2.7 Параметры проведения массспектрометрического анализа и выбор типа
массспектрометра
3.2.8 Статистические методы обработки данных
4 Результаты
4.1 Основные результаты работы
4.2 Построение калибровочных кривых зависимости интенсивности масс
спектрометрического сигнала от концентрации индивидуального белка
4.2.1 Математическое определение функции зависимости сигнала от
концентрации
4.2.2 Теоретические основы зависимости ответного сигнала от
концентрации
Границы линейности корреляции
Приборнотехнические ограничения массспектральной интенсивности
Условия выполнения гипотезы о линейности корреляции между уровнем массспекфометрического сигнала и концентрацией белков
Минимальное число пептидов как условие выполнения линейной зависимости интенсивности массспектрометрического сигнала от концентрации пептидов анализируемых белков
Угол наклона кривой зависимости
Определение зависимости массспектрометрического сигнала белков от концентрации в модельных смесях
Постоянство линейной зависимости уровня интенсивности массспектрометрического сигнала от концентрации пептидов белков в смеси
Отличия интенсивности белков в смеси и в чистом препарате
Сохранение условий линейности сигнала от концентрации пептидов и характеристического значения тангенса угла наклона кривой зависимости
Влияние скорости потока наноэяекгроспрея на линейность корреляции
Сравнение результатов разрабатываемой гипотезы о корреляции интенсивности массспектрометрического сигнала и концентрацией пептидов с современными общепринятыми методами относительной количественной протеомики
Метод
Критерии селекции пептидов
4.5.1.2 Оценка качества идентификации массспектров пептидов с атомами ЬС,
4.5.1.3 Экстраполяция данных для пептидов с включенными изотопными
атомами С, 1М и расчет концентрации пептидов и в смеси
4.5.2 Замещение тяжелыми атомами кислорода 0 в ходе реакции гидролитического расщепления трипсином
4.5.2.1 Качественная оценка замещения легких атомов кислорода 1бО на 1аО с
помощью МА1 масс спектрометрии.
4.5.2.2 Относительная количественная оценка с помощью пептидов
4.6 Основные характеристики рабочей гипотезы зависимости сигнала масс
спектрометрической интенсивности от концентрации пептидов
5 Обсуждение
5.1 Введение. Актуальность количественной протеомики
5.2 Необходимость безметковых методов количественной протеомики с использованием массспектрометрии
5.3 Оптимизация приборноизмерительной базы и ограничения методов количественной протеомики
5.4 Сложности в обработке данных количественной массспектрометрии
5.5 Линейность зависимости массспектрометрического сигнала от концентрации пептидов и динамические диапазоны детекции
5.6 Верификация гипотезы о линейной зависимости между интенсивностью массспектрометрического сигнала и концентрацией пептидов общепринятыми методами относительной количественной протеомики
С Выводы
7 Заключение
Список цитируемой литературы


Нами также были подобраны оптимальные условия скорости потока наноэлсктроспрея применимые для поведения количественной оценки белков на ионных ловушках. Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанный нами метод позволяет эффективно решать поставленные проблемы в количественной протеомики для оценки содержания белковых компонентов В 6ИОЛ ических пробах и в чистых препаратах без использования химических или метаболических меток, содержащих атомы тяжелых изотопов. Разработан общий подход к оптимизации условий метода количественной оценки белков с использованием массспектрометрии на примере ионной ловушки и нормализации и выравниванию данных для эффективного выявления линейности зависимости массспектрометрической интенсивности ответного сигнала от концентрации анализируемого белка в чистом препарате и в смеси белков. ОТНОСИТЕЛЬНОЙ И АБСОЛЮТНОЙ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПРОТЕОМИКИ. В современной науке техника протеомного анализа находится в неразрывной связи с другими отраслями системной биологии. Обладая широкими возможностями, количественная протеомика оперирует колоссальным массивом данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе жизни. Достижения протеомики помогают исследователям решать сложные вопросы клеточной сигнализации, пострансляционных модификаций, структурной и функциональной гомологии белков, молекулярной диагностики. В протеомике было разработано свыше различных методов для осуществления количественного анализа, и, хотя, каждый из них посвоему уникален и обладает рядом преимуществ и недостатков, все их можно объединить под единым флагом использования изотопной метки. В обзоре рассмотрены современные подходы количественной протеомики. Из всего многообразия в технике количественного анализа, мы рассмотрим наиболее популярные и самые эффективные, как с использованием химических модификаций белков, так и метаболические и ферментативные методы включения изотопной метки. Протеомика системное исследование структуры, функции и активности белков, белокбелковых взаимодействий, определение уровня экспрессии генов. Основной вклад в развитие современной количественной протеомики внесла технология химической модификации белковых молекул. Зародившись еще в х годах прошлого столетия, она заложила прочный фундамент технологии применения модификационной белковой химии, как основного инструмента, позволяющего осуществлять абсолютные и относительные количественные измерения белковых молекул, даже прошедших стадию посттрансляционных изменений. Появление так называемых изотопных меток получило широкое применение и признание в научном мире, как наиболее эффективное решение исследовательских вопросов в протеомике. Количественная протеомика обеспечивает системный анализ о содержании белков и их модифицированных форм. Огромный вклад в развитие протеомики внес метод двумерного электрофореза РАбЕ. Приблизительно с середины х годов и на протяжении более лет, РАСЕ занимал основное место в методологии количественной протеомики благодаря своей высокой разрешающей способности. На рисунке 1 представлена схема определения содержания белковых продуктов достигалось, в общем случае, сравнительным анализом окрашенных гелей, на которых представлены разделенные белковые молекулы из лизата клеток в различных состояниях, и последующей их идентификацией МБ анализом массспектрометрией. Рисунок 2. Идентификация белков в биопробах. Белки из лизата клеток разделяют в геле методом двумерного электрофореза. Пятна из окрашенных гелей вырезают и проводит гидролиз белков в геле. Полученные пептиды анализируют снятием массспектров. Относительная количественная оценка осуществляется при сравнении протеомного профиля двумерных карт и денситометрировании пятен, соответствующих белков. Однако, высокой воспроизводимости экспериментов достигнуть было сложно изза различной чувствительности окрашивающих агентов, условий полимеризации акриламидных гелей и разделения белков, а также многостадийности в подготовке гелей первого и второго направлений. Попытки преодоления этих проблем привели к разработке дифференциального двумерного электрофореза СЕ рисунок 2.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.182, запросов: 145