Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства

Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства

Автор: Коломыцева, Марина Павловна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Пущино

Количество страниц: 151 с. ил.

Артикул: 2881816

Автор: Коломыцева, Марина Павловна

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
Введение
Обзор литературы.
Глава 1. Структурнофункциональные аспекты иитрадиольного расщепления
ароматического кольца ключевой реакции микробной деградации
ароматических соединений.
1.1. Метаболические пути деградации ароматических соединений, ведущие к образованию ключевых интермедиатов
1.2. Пути разложения ключевых интермедиатов.
1.3. Генетические, физикохимические и структурные аспекты ннтрадиольиых диоксигеназ
1.3.1. Степень идентичности аминокислотных последовательностей
1.3.2. Физикохимические свойства.
1.3.3. Структурные свойства.
1.3.3.1. Физические свойства кристаллов.
1.3.3.2. Архитектура молекул.
1.3.3.3. Координационная сфера Ре3 активного центра
1.3.3.4. Механизмы связывания и расщепления субстрата
1.3.3.5. Взаимосвязь кинетических параметров и структуры ферментов. Характер взаимодействия субстратов и их аналогов с активным центром
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Штамм, использованный в работе.
2.2. Культивирование штамма.
2.2.1. Состав сред
2.2.2. Приготовление субстратов.
2.2.3. Проведение ферментаций и получение биомассы
2.3. Выделение ферментов
2.3.1. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка.
2.3.2. Определение активности ферментов.
2.3.3. Очистка4хлорпирокатехнн 1,2диоксигеназы
2.3.4. Очистка 3хлорпирокатехин 1,2диоксигеназы.
2.4. Определение кинетических характеристик ферментов.
2.5. Кристаллизация ферментов.
2.6. Рентгеноструктурный анализ.
2.6.1. Предварительный рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов
2.6.2. Рентгеноструктурный анализ, проводимый для разрешения трехмерной структуры ферментов.
2.7. Методы структурного анализа
2.7.1. Структурный анализ белковых молекул
2.7.2. Структурный анализ молекул субстрата и его аналогов
Глава 3. Результаты.
4 3.1. Очистка ферментов
3.1.1.4хлорпирокатехин 1,2диоксигеназа
3.1.2. 3хлорпирокагехин 1,2диоксигеназа.
3.2. Кинетические свойства хлорпирокатехии 1,2диоксигеназ
3.2.1. Субстратная специфичность ферментов
3.2.2. Ингибирование ферментов фенолом, его замещенными производными и бензоатом.
3.2.3. Структурные свойства субстратов и их аналогов
3.2.4. Связь функционирования хлорпирокатсхин 1,2диоксигеназ с структурой субстратов и их аналогов
3.2.4.1. Связывание замещенных фенолов ферментами
3.2.4.2. Связывание замещенных пирокатехинов и его аналогов ферментами.
3.2.4.3. Катализ замещенных субстратных аналогов.
3.2.4.4. Избирательность хлорпирокатехин 1,2диоксигеназ в отношении заместителя в положении СЗС4 бензольного кольца субстрата.
3.4. Кристаллизация ферментов
3.4.1. Получение кристаллов 4хлорпирокатехин 1,2диоксигеиазы
3.4.2. Получение кристаллов 3хлорпирокатехин 1,2диоксигеиазы
3.5. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2диоксигеназ, связь структуры и функции
3.5.1. Общая структура молекул
3.5.2. Молекулярная поверхность входа в активный центр хлорпирокатехин 1,
диоксигеназ в сравнении с подобными структурами интрадиольных дноксигеназ известной структуры
3.5.3. Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,
диоксигеназ
3.5.4. Форма и структура активных центров хлорпирокатехин 1,2диоксигеназ.
3.5.5. Сравнительный анализ структуры активного центра 4хлорпирокатсхип
1,2диоксигеназы с структурами активных центров известных
ин градиольных дноксигеназ
3.5.5.1. Структуры активных центров, соответствующие С4атому бензольного кольца субстрата или субстратного
аналога.
3.5.5.2. Структуры активных центров, соответствующие СЗатому бензольного кольца субстрата или субстратного
аналога.
3.5.5.3. Структуры активных центров, соответствующие Сбатому бензольного кольца субстрата или субстратного
аналога.
Обсуждение результатов.
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2,3ДГБ 1,2ДО 2,3дигидроксибифснил 1,2диоксигеназа ГГХ 1,2ДОгидрокси гидрохинон 1,2диоксигеназа
ГГХ 1,2ДОА.т. гидрокснгидрохипон 1,2диоксигеназа из iiix ЗЕ ГПКК 2,3ДО гомопротокатехат 2,3диоксигеназа ИК инфракрасное излучение ПК 1,2ДОпирокатехин 1,2диоксигеназа
ПК 1,2ДОЛс пирокатехин 1,2диоксигеназа из i . ПК 2,3ДО пирокатехин 2,3диоксигеназа ПКК 2,3ДО протокатехат 2,3дноксигсназа ПКК 3.4ДО протокатехат 3,4диоксигсназа
ПКК 3,4ДОз.7 протокатехат 3,4диоксигепаза из i
ПКК 3,4ДО1с протокатехат 3,4диоксигеназа из i .
ПКК 4,5ДО протокатехат 4,5диокснгсназа
РАС рентгеноабсорбцнонная спектроскопия
РСА рентгепоструктурный анализ
ХПК 1,2ДОхлорпирокатсхип 1,2диоксигеназа
ЭПРэлектронный парамагнитный резонанс
ЯМР ядернын магнитный резонанс
Обозначения аминокислотных остатков, входящих в состав белков.
Полное название аминокислоты Сокращенное название
трехбуквенное однобуквенное
Аланин
Аргинин
Аспарагин
Аспарагиновая кислота
Валин V V
Г истндин i
Глицин
Глутамин i
Глутаминовая кислота П
Изолейинн i
Лейцин
Лизин К
Метионин
Пролип
Серии
Тирозин
Треонин
Триптофан
Фенилаланин
Цистеин С
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


СПК сульфопирокатсхин, Нф нафталин, Фт фталиеая кисюта. ХФУК полихлорфеноксиутсусныс кислоты. ГФУК пироксифсноксиуксусная кислота, фер феруловая кислота, Ван ванильная кислота, Рез резорцин, 2,4ДНТ 2,4динитротолуол. Феи фенантрен, Фл флуорен. ДБФ дибензофуран. ГДБФ гидроксидибснзофуран, ДБпД дибеюопдиоксии, ГДБцД гидроксидибсизоидиоксин. Кар карбазол, ДХДБпД дихлордибекюпдиоксин. Горлатов с соавт. М., , хлораннлнпы . Суровцева с соавт. Через замещенные пирокатехины также способны разлагаться следующие соединения метнлбензолы через мети л пирокатехины i . Другой ключевой метаболит, протокатехат ПКК образуется при деградации моно и полиароматических соединений Рис. А галлата 3,4,5тригидроксибензойная кислота , . Ii . Ii . Зайцев и Карасевич, v vv . Ii . Незамещенный гидроксигидрохин ГГХ является продуктом разложения ряда соединений Рис. I ванильной кислоты и изомерных тригилроксилированнмх бензолов, образующихся в свою очередь при деградации растительных материалов, таких как гликозиды, флавоноиды, танины и лигнин i . Vi . Vi. Vi . Vi . Хлорзамещенные гидроксигидрохиноны могут образовываться также при разложении полихлорфенолов . X, i . В дальнейшем пирокатехин и его аналоги подвергаются раскрытию ароматического кольца посредством включения в молекулу субстрата молекулярного кислорода , , , . Этот процесс осуществляется двумя способами Рис. В ходе реакции обязательным требованием для такого рода субстратов является наличие двух смежных гидроксильных iзаместителей в ароматическом кольце. Рис. Способы расщепления пирокатехина и его замещенных аналогов диокспгсназамн а дистальное экстрадиольнос, интрадиольное, с проксимальное экстрадиолыюе. Интрадиольное расщепление Рис. Ь заключается в разрыве двойной СС связи между двумя соседними в о7иоположеиии гидроксильными группами и осуществляется интрадиольными диоксигеназамн , . ДГВ 1. II ДДО0, XII 1,2ДОО, ГГХ 1,2ДОО, хггх . ПКК 4. II 2ДД, ПКК 2. ПКК 3,4ДО i vi, , пирокатехин и хлорпирокатехин 1,2диоксигеназами ПК 1,2ДО и ХПК 1,2ДО ii . ГГХ 1,2ДО и ХГГХ 1,2ДО , i . Экстрадиольиое мета расщепление ароматического кольца может осуществляться двумя способами дистальным Рис. СС связи между 6м и 1м углеродными атомами, и проксимальным Рис. СС связи между 2м и 3м атомами углерода. К экстрадиольным диоксигеназам, осуществляющим дистальный разрыв, относятся 2,3дигидрокснбифеннл 1,2диоксигеназы 2,3ДГБ 1,2ДО, активно расщепляющие как 2,3дигидроксибнфенилы так и пирокатехин с хлорпнрокатехином i . Vi . Ферментами, проксимально раскрывающими ароматическое кольцо, являются протокатехат 4,5диоксигеназы ПКК 4,5ДО , i . ПКК 2,3ДО i . ПК 2,3ДО i . ГПКК 2. ДО i i, Vi . Протокатехат 4,5 и 2,3диоксигсназы используют в качестве субстрата протокатехат, пирокатехин 2,3диоксигеназы пирокатехин, и гомопротокатехат 2,3диоксигеназы гомопротокатехат. Интрадиольныс и экстрадиольныс диоксигсиазы, не смотря на схожие по структуре субстраты, имеют много различий. Ферменты обоих семейств значительно отличаются по структуре молекул, а также их активных центров. Так интрадиольныс диоксигсиазы содержат пятикоординированное трехвалентное железо 3, напротив, в активном центре экстрадиольных диоксигеназ могут находиться четырехкоординированные двухвалентное железо 2 или двухвалентный нон марганца Мп2. Следствием этого становится появление существенных различий ферментов в механизмах раскрытия ароматического кольца субстрата и образования, соответственно, разного типа продутов Рис. Более подробно остановимся на процессе интрадиольного расщепления ароматического кольца и ферментах, катализирующих данную реакцию Рис. Все пути микробного интрадиольного орто расщепления ключевых метаболитов, в дальнейшем, сливаются в общий 3оксоадипатный путь, приводящий, в конечном итоге, к образованию интермедиатов цикла трикарбоновых кислот Рис. Зтлорпирокитслии 4лорпнрокатени 3. МКК 3. II М д. Х ПК 1Д. ДО
ча. Мс2ж. ЦП а 1ИГ И. Рис. Интрадиольное расшсилснне ключевых интермедиатов. А Iилроксиидрохииоия, Ь 6х. I идрохннона. В проюкатеховой кислоты. Г классический ортапухъ расшсп.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.206, запросов: 145