Создание и изучение биологических свойств кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ

Создание и изучение биологических свойств кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ

Автор: Мурашев, Борис Владимирович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 196 с. ил.

Артикул: 3390965

Автор: Мурашев, Борис Владимирович

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности развития ВИЧинфекции и возможность создания вакцины против ВИЧ
1.1.1. Развитие ВИЧинфекции и уход вируса из под иммунной атаки
1.1.2. Перспективность вакцинирования против ВИЧинфекции.
1.1.3. Значимость ЦТЛответа при вакцинации против ВИЧинфекции
1.1.4. Значимость Iответа при вакцинации против ВИЧинфекции
1.1.5. Значимость хелперного ответа, опосредованного 4 Тлимфоцитами, при вакцинации против ВИЧинфекции.
1.2. ДНКвакцины
1.2.1. Структура и отдельные элементы ДНКвакцины.
1.2.2. Потенциальные преимущества ДНКвакцин перед традиционными подходами.
1.2.3. Экспрессия и презентация антигена, специфика иммунного
1.2.4. Эффективность трансформации и возможность интеграции в
1.2.5. Самоадъювация ДНКвакцин за счет последовательностей
1.2.6. Иммунологическое усиление ДНКвакцин.
1.3. ДНКвакцины против ВИЧ
1.3.1. Возможность создания субтипической и субтипнсзависимой вакцины.
1.3.2. ДНКвакцина как прайм при иммунизации
1.3.3. Доклинические и клинические испытания ДНКвакцин против ВИЧинфекции, проводящиеся в мире.
1.4. Методы очистки ДНКвакцин и стандарты их качества.
1.4.1. Различные методы очистки ДНКвакцин
1.4.2. Контроль качества препаратов ДНКвакцин
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Методы генноинженерных манипуляций с ДНК.
2.1.1. Плазмидные ДНК, использованные в работе
2.1.2. Реакции ферментативной модификации ДНК.
2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция.
2.1.2.2. Реакция рестрикции плазмидной ДНК.
2.1.2.3. Реакция обработки ДНКчюлимеразой фага Т4 Т4 ДНКпол
2.1.2.4. Реакция обработки ДНК щелочной фосфотазой из кишечника теленка I
2.1.2.5. Реакция лигирования фрагментов ДНК.
2.1.2.6. Реакция ферментативного секвенирования ДНК.
2.1.3. Электрофорез нуклеиновых кислот
2.1.3.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле
2.1.3.2. Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля.
2.1.3.3. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях.
2.1.4. Микробиологические методы
2.1.4.1. Приготовление компетентных клеток .i для трансформации.
2.1.4.2. Трансформация клеток . i.
2.1.4.3. Скрининг рекомбинантных клонов на наличие искомой
плазм шдной ДНК.
2.1.4.4. Масштабное культивирования клеток .i продуцентов плазмидных ДНКвакцин.
2.2. Очистка нуклеиновых кислот
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из клеток .i
2.2.2. Очистка ДНК между ферментативными реакциями
2.2.3. Концентрирование нуклеиновых кислот
2.2.4. Очистка плазмидной ДНК в градиенте плотности хлористого
цезия с бромистым этидием.
2.2.5. Хроматографическая очистка плазмидной ДНК
2.2.6. Выделение тотальной РНК из трансформированных кзльтур клеточных линий.
2.3. Контроля качества препаратов плазмидных ДНК.
2.3.1. Определение содержания суперскрученной формы плазмид.
2.3.2. Определение содержания РНК в препаратах плазмидных ДНК.
2.3.3. Определение содержания хромосомной ДНК .i в препаратах
плазмидных ДНК
2.3.3.1. Подготовка проб к анализу
2.3.3.2. Перенос и иммобилизация ДНК на фильтрах
2.3.3.3. Получение специфического меченого зонда
2.3.3.4. Проведение гибридизации ДНК
2.3.4. Определение спектрофотометрических показателей препаратов плазмидных ДНК и РНК
2.3.5. Определение содержания белка в препаратах плазмид
2.3.6. Определение содержания эндотоксинов в препаратах плазмид.
2.3.7. Методы идентификации плазмид
2.3.8. Определение стерильности препаратов плазмид.
2.4. Анализ экспрессии генов ВИЧ1 i vi.
2.4.1. Культуральные методы
2.4.1.1. Линии клеток, среды и условия культивирования
2.4.1.2. Трансформация клеток млекопитающих.
2.4.1.3. Определение эффективности трансформации с помощью проточного цитофлуориметра
2.4.2. гибридизация.
2.4.2.1. Перенос и иммобилизация препаратов РНК на фильтрах.
2.4.2.2. Получение специфических меченых зондов.
2.4.2.3. Проведение гибридизации РНК
2.4.3. Иммуноблотинг.
2.4.3.1. Получение образцов.
2.4.3.2. Электрофорез белков в ПААГ.
2.4.3.3. Перенос препаратов белков на фильтр
2.4.3.4. Проведение иммунологического окрашивания белков
2.4.4. Анализ экспрессии гена с помощью проточного цитофлуориметра
2.5. Иммунологические методы исследования.
2.5.1. Иммунизация мышей и забор иммунологических проб.
2.5.2. Анализ специфической активности ЦТЛ.
2.5.2.1. Выделение эффекторных лимфоцитов.
2.5.2.2. Цитотоксический анализ с использованием набора x .
2.5.2.3. Цитотоксический анализ с использованием проточного цитофлуориметра.
2.5.3. Анализ 8 спленоцитов иммунизированных мышей.
2.5.4. Анализ 4 спленоцитов иммунизированных мышей.
2.5.5. Иммуноферментный анализ ИФА.
2.5.6. Анализ неспецифической стимуляции лимфоцитов мыши плазмидной ДНК i vi
2.6. Обработка результатов и статистический анализ данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание плазмидного экспрессионного вектора рВМС
3.2. Создание плазмид на основе вектора рВМС.
3.3. Очистка плазмидных ДНК
3.3.1. Хроматографическая очистка плазмидных ДНК
3.3.2. Контроль качества плазмидных ДНК.
3.4. Изучение свойств полученных плазмид i vi
3.4.1. Анализ экспрессии генов ВИЧ1 i vi
3.4.2. Неспецифическая стимуляция лимфоцитов мыши плазмидами i vi
3.5. Результаты лабораторных иммунологических испытаний препаратов кандидатных ДНКвакцин
3.5.1. Результаты сравнительнх испытаний ДНК вакцин на основе вектора рВМС и других векторов, полученных соисполнителями Биомедицинского центра по данной тематике
3.5.2. Результаты иммунологических испытании ДНКвакцин несущих гены ВИЧ1 субтипа В.
3.5.3. Некоторые результаты доклинических испытаний кандидатных ДНКвакцин несущих гены ВИЧ1 субтипа А
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Создание плазмидного экспрсссионного вектора рВМС и серии плазмидных ДНКвакцин.
4.2. Оптимизация штаммапродуцента
4.2. Очистка плазмидных ДНКвакцин
4.3. Свойства кандидатных ДНКвакцин в системе i vi.
4.4. Изучение иммунологических свойств кандидатных ДНКвакцин на мышах.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Уровень вариабельности различается в разных областях генома ВИЧ. Так, гены и являются наиболее консервативными участками генома, тогда как в гене v существуют гипервариабельные участки с очень высокой изменчивостью 0. Такое свойство наиболее сильно выражено для вирусных антигенов, служащих источником эпитопов, распознаваемых нейтрализующими антителами, и экспонированных на плазматической мембране. Как следствие этого, уровень мутаций белка ВИЧ1 намного выше, чем, например, нейромидазы вируса гриппа. До аминокислотных остатков в подвержены мутациям, а в У3иетле этой молекулы, одном из перспективных нейтрализующих доменов, до различных аминокислот могут быть обнаружены в одинаковых положениях 7. КГ3 нуклеотидных замен на один нуклеотид в год, а в гене 4 0. Это намного больше приблизительно в 6 раз скорости мутирования клеточного генома 2. Антигенный дрейф характерен для большинства других РНКсодержащих вирусов. Так, полиовирус существует в трех субтипических вариантах, и, хотя мутации возникают в каждом субтипе, тем не менее, вакцины сохраняют эффективность. Кроме высокой вариабельности, которую проявляет область У3петли , данный домен белка обладает доминирующей антигенной специфичностью. Напротив, сайт связывания с клеточным рецептором 4 является консервативным, но обладает слабыми иммунногенными свойствами 1. Кроме того, существование эффекта первородного антигенного греха ii ii i иммунного ответа делает невозможным переключение иммунного ответа с эпитопов антигена, которым была праймирован организм, на эпитопы того же антигенаантигенов, которые возникли в организме в результате генетических модификаций во время патогенеза ВИЧ. Эффект первородного антигенного греха наблюдается не только при ВИЧ1, но и при инфекции вирусом гриппа, Денге и малярийным плазмодием 0. Причем данный парадокс относится как к гуморальной, так и к клеточной форме иммунного ответа. Следует отметить, что высокий уровень гликозилирования делает данный объект иммунологически сложным. Кроме того, существование широкого паттерна альтернативного гликозилирования поверхностного белка ВИЧ1 различными типами клеток только усугубляет ситуацию активации, образования и взаимодействия антител с различными модификациями антигена . Многие вирусы инфицируют клетки иммунной системы. ВЭБ и V6. ВИЧ инфицирует и поражает ключевые клетки иммунной системы, в частности 4 Тлимфоциты, макрофаги и дендритные клетки 9. Он был также обнаружен в 8 Тклетках, на фолликулярных дендритных клетках в лимфоидных тканях, взаимодействует с Мклеткам пейеровых бляшек и к галактозилцереброзидпозитивным клеткам в головном мозге и кишечнике. Используя клеточные рецепторы для инициации процесса инфицирования, ВИЧ1 осуществляет угнетение иммунной системы. По мере увеличения репликативной активности вируса происходит высвобождение белка из инфицированных клеток. Кроме того, наблюдается процесс сшелушивания i с поверхности зрелых вирионов. Как следствие, происходит взаимодействие не связанного с вирусом белка с поверхностью 4 Тклеток. Занятость рецептора ограничивает возможность участия этих клеток в развитии иммунных реакций 1. Существует гипотеза x i, согласно которой ретровирусы способны использовать клеточные эндосомы как депо, недоступное для иммунной системы . Данная теория позволяет объяснить, каким образом происходит рецепторнезависимая инфекция клеток, не несущих на своей поверхности основной корецептор 4. Например, известно, что вирионы ВИЧ1 находятся внутри эндосом в макрофагах и дендритных клетках 9. Показано, что удаление гена v не лишает вирус способности инфицировать клетки 8. Несмотря на низкую эффективность рецепторнезависимого инфицирования, данный механизм способствует избеганию взаимодействия вирусных частиц со специфическими антителами и предотвращению обычного пути заражения с помощью нейтрализующих антител. Причем эндосомный способ передачи вирусных частиц характерен не только для ВИЧ1, но и для всех ретровирусов. Существует определенный баланс между формой иммунного ответа и эффективностью развития и патогенеза ВИЧ1 у индивидуума.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.221, запросов: 145