Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии

Автор: Рунова, Ольга Леонидовна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 1999

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 108 с. ил

Артикул: 2285142

Автор: Рунова, Ольга Леонидовна

Стоимость: 250 руб.

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии  Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии 

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Общая характеристика рецептора ЛНП.
1.2. Мультидоменная структура рецептора ЛНП.
1.3. Структурнофункциональная организация лигандсвязывающего
домена рецептора ЛНП.
1.4. Структура гена РЛНП.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Штаммы . i, питательные среды, условия роста.
2.2. Плазмидные векторы.
2.3. Выделение плазмидной ДНК.
2.4. Трансформация .i. г.
2.5. Гйбридизация.
2.6. Очистка рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП, слитого
с галактозидазой.
2.7. рЕТ система.
2.7.1. Индукция 3 лизогенов.
2.7.2. Получение клеточного экстракта и белков культуральной среды для хроматографии на смоле ii.
2.7.3. Подготовка смолы ii и аффинная хроматография.
2.8. Культивирование фибробластов человека линии НТ и получение
клеточных лизатов.
2.9. Получение антител к рекомбинантному лигандсвязывающему домену
РЛН человека.
2 Денатурация и рефолдинг рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП.
2 Оценка лигандсвязывающей активности рекомбинантного белка
в иммунохимическом тесте на микроячеечных планшетах.
2 Визуализация РЛНП в белках клеточных лизатов и рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП с помощью и ммуноблоттинга и лигандного блоттинга.
21. Иммуноблоттинг.
22. Лигандный блоттинг.
2 Аналитические методы.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВА1ИЙ.
3.1. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии X.
3.2. Выделение рекомбинантного лигандсвязывающего домена 1I1 в виде
слитого белка.
3.3. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии рЕТ.
3.4. Выделение лигандсвязывающего домена рецептора ЛНП в виде рекомбинантного индивидуального белка.
3.5. Характеристика антител к рекомбинантному лигандсвязывающему домену рецептора ЛНП.
3.6. Анализ функциональной активности рекомбинантного лигандсвязывающего
домена рецептора ЛНП.
3.7. Исследование взаимодействия белков ii i с ЛНП человека.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями 1 для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лигандсвязывающего домена 2 наличие индивидуального белка лигандсвязывающего домена РЛНП имеет существенное значение для выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этом домене 3 на основе рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тестсистема для изучения структурных аномалий ЛНПчастиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП 4 лигандсвязывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринсмии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лигандсвязывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные как правило, концевые фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов i . . РНК, сдвига рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др. Рекомбинантные лигандсвязывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецепторлиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и но последовательности аминокислот лигандсвязывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью i . В связи с этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоспецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме. Цели и задачи исследования. Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лигандсвязывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимичсской специфичности и функциональной активности. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лигандсвязывающий домен РЛНП, на основе векторов серий X и рЕТ и плазмиды З, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках. Разработка процедур выделения рекомбинантного лигандсвязывающсго домена РЛНП в виде гомогенного белка. Полуденне антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека. Оптимизация процедур восстановленияденатурации и рсфолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНПсвязывающей активностью. Научная новизна работы. Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лигандсвязывающий домен РЛН человека продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах . Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановленияденатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальцийзависимой ЛНПсвязывающей активности. Практическая значимость работы. Полученные антитела к рекомбинантному лигандсвязывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лигандсвязывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНПсвязывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тестсистемы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛМ из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.194, запросов: 145