Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума : Молекулярные механизмы регуляции активности

Кальций-транспортирующие системы мембран саркоплазматического ретикулума : Молекулярные механизмы регуляции активности

Автор: Рубцов, Александр Михайлович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2003

Место защиты: Москва

Количество страниц: 247 с. ил.

Артикул: 2616972

Автор: Рубцов, Александр Михайлович

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Строение и функции саркоилазматического ретикулума
1.1. Общие аспекты
1.2. Сасвязывающие белки саркоилазматического ретикулума Глава 2. Саканалы рианодиновыс рецепторы саркоплазматичсского ретикулума
2.1. Виды внутриклеточных Саканалов
2.2. Идентификация и выделение Саканалов СР рианодиновых рецепторов
2.3. Структура Саканалов саркоплазматического ретикулума
2.4. Проводимость Саканалов СР для одновалентных и двухвалентных катионов
2.5. Изоформы рианодинового рецептора и особенности электромеханического сопряжения в разных типах мышц
2.6. Взаимодействие рианодинового рецептора с белками саркоилазматического ретикулума
2.7. Регуляция активности Саканалов СР эндогенными и экзогенными соединениями
2.8. Участие протеинкиназ в регуляции функциональной активности рианодинового рецептора
2.9. Возможные механизмы нарушения работы Саканалов при мышечном утомлении
Глава 3. СаАТФаза саркоплазматического ретикулума
3.1. Молекулярная организация СаАТФазы
3.2. Механизм функционирования СаАТФазы
3.3. Регуляция активности СаАТФазы
3.4. Олигомерная организация СаАТФазы в мембранах СР Глава 4. Гистидинсодержащие дипептиды и их возможные физиологические функции
4.1. Участие карнозина в процессах мышечного сокращения
4.2. Буферные свойства карнозина
Глава 5. Использование мелитгина для исследования биологических мембран и мембранных ионтранспортирующих АТФаз Ртипа
5.1. Структура молекулы мелитгина
5.2. Взаимодействие мелиттина с мембранами и мембранными ферментами
5.3. Мелиттинподобные белки Глава 6. Гибернация млекопитающих
6.1. Общие аспекты
6.2. Особенности энергетического обмена в сердце и скелетных мышцах при гибернации
6.3. Адаптационные изменения сократительных белков при гибернации
6.4. Изменения метаболизма Са2в сердце и скелетных мышцах при гибернации
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
III.1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
1.1. Выделение препаратов легкого саркоплазматического ретикулума
1.2. Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из скелетных мышц
1.3. Выделение препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума из сердца утки
1.4. Получение мембранных и цитозольных фракций из слизистой оболочки желудка и скелетных мышц кролика
1.5. Получение липосом и протеолипосом с различным содержанием белка СаАТФазы в мембране
1.6. Иммунизация кроликов мелиттином и получение антимелиттиновых
антител
1.7. Выделение мелитгинподобного белка методом аффинной хроматографии
1.8. Получение имидазольной соли АТФ и ГТФ
1.9. Получение декаванадата и Е2кристаллов СаАТФазы
.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури
2.2. Определение концентрации белка по методу Спектора
2.3. Определение количества фосфолипидов но
неорганическому фосфору
2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.5. Определение активности СаАТФазы с использованием системы сопряженных ферментативных реакций
2.6. Определение активности СаАТФазы по нарастанию неорганического фосфата
2.7. Определение активности СаАТФазы методом непрерывной регистрации в слабозабуференной среде
2.8. Определение паранитрофенилфосфатазной активности СаАТФазы
2.9. Регистрация АТФзависимой аккумуляции Са2 и лигандиндуцируемого выброса Са2
2 Регистрация выхода Са2 из пассивно нагруженных
везикул СР с использованием Са2
2 Ингибирование активности СаАТФазы мелиттином
2 Температурная обработка мембран саркоплазматичсского ретикулум а
2 Определение количества БНгрупп и их кинетических параметров с помощью НБДхлорида
2 Анализ инактивации СаАТФазы препаратов СР НБДхлоридом
2 Определение значений кажущихся Кд для нуклеотидов, обеспечивающих защиту СаАТФазы от инактивации НБДхлоридом
2 Получение НБДмеченых препаратов СаАТФазы для флуоресцентных исследований
2 Электронная микроскопия
2 Включение ФИТЦ, ЭИТЦ и ИАЭ в СаАТФазу
2 Регистрация анизотропии фосфоресценции меченых ЭИТЦ и ИАЭ препаратов СаАТФазы
2 Регистрация генерации вторых гармоник поверхностью мембран СР
2 Исследование свойств липидной фазы мембран саркоплазматического рстикулума с использованием флуоресцентных зондов
2 Анализ тушения собственной флуоресценции СаАТФазы гидрофобными и гидрофильными соединениями
2 Исследование структурного состояния липидной фазы мембран методом ЭГТР
2 Анализ гидроксилрадикал связывающей способности карнозина и родственных ему соединений с использованием метода спиновых ловушек
2 Измерение поверхностного потенциала мембран СР с помощью рНчувствитсльного индикатора нейтрального красного
2 Определение титра сыворотки с помощью твердофазного иммуноферментного анализа
2 Иммуноблоттинг
2 Анализ олигомеризации белка СаАТФазы в присутствии фенантролина и ионов меди
2 Определение уровня включения фосфата в белки саркоплазматического ретикулума
2 Авторадиография
Ш.З. ЖИВОТНЫЕ
Ш.4. МАТЕРИАЛЫ
Ш.5. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА
ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Характеристика используемых в работе препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума и методических подходов для исследования выхода Са2
Глава 2. Влияние производных 1,4дигидропиридина на свойства Саканалов ретикулума
Глава 3. Характеристика Са2 и кофеининдуцируемого выброса Са2 из препаратов тяжелого СР и поиск кофеинсвязывающих белков
Глава 4. Регуляция Саканалов СР карнозином и родственными соединениями
4.1. Активация Саканалов гистидинсодержащими соединениями
4.2. Влияние карнозина на взаимодействие Саканалов с регуляторами их функциональной активности
4.3. Гидроксилрадикалсвязывающая активность карнозина
Глава 5. Анализ нуклеотидсвязывающих свойств Саканалов и альтернативные пути выхода Са2 из везикул саркоплазматического ретикулума
Глава 6. Анализ нуклеотидсвязывающнх свойств СаАТФазы саркоплазматического ретикулума и влияние лигандов
на конформационнос состояние молекулы фермента
6.1. Химическая модификация БНгрупп СаАТФазы НБДхлоридом
6.2. Защита адениловыми нуклеотидами СаАТФазы СР
от инактивации НБДхлоридом
6.3. Анализ флуоресценции НБДмсченой СаАТФазы
6.4. Генерация вторых гармоник мембранными препаратами СР
6.5. Гидролиз разных субстратов СаАТФазой СР 5 Глава 7. Олигомерная организация СаАТФазы в мембранах СР
7.1. Электронная микроскопия
7.2. Сшивающие агенты
7.3. Анизотропия фосфоресценции 1 Глава 8. Влияние агрегации СаАТФазы в мембранах ретикулума на активность фермента
8.1. Терморазобщение Санасоса
8.2. Агрегация СаАТФазы, индуцируемая мелитгином 8 Глава 9. Мслитгин как инструмент для исследования СаАТФазы
9.1. Взаимодействие мелиттина с мембранами СР
9.2. Особенности ингибирования СаАТФазы СР мелитгином
9.3. Влияние АТФ и ГТФ на ингибирование СаАТФазы мелитгином
9.4. Ингибирование СаАТФазы мелитгином при низких концентрациях АТФ в среде измерения активности
9.5. Ингибирование мелитгином гидролиза пНФФ СаАТФазой СР
9.6. Ингибирование мелитгином солюбилизированной СЕ9 СаАТФазы и термообработанного и обработанного глицерином препаратов СР
9.7. Идентификация мелитгинподобных белков в разных
тканях кролика
9.8. Очистка мелитгинподобного белка и его влияние на активность СаАТФазы саркоплазматического ретикулума
Глава . Регуляция активности СаАТФазы СР при гибернации сусликов iii
.1. Сравнительная характеристика препаратов СР скелетных мышц сусликов, крыс и кроликов
.2. Сезонные изменения белкового состава мембран СР сусликов
.3. Сезонные изменения активности СаАТФазы СР скелетных мышц сусликов
.4. Роль протеинкиназ в сезонной регуляции активности СаАТФазы СР скелетных мышц суслика .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ


Предполагаемое расположеиие в мономере гидрофобных аспиральных участков, погруженных в мембрану СР и формирующих гидрофобный домен молекулы Саканала изображены в виде цилиндров, и гидрофильных участков и Сконцевыс участки молекулы и цитоплазматические петли, соединяющие гидрофобные аспирали, формирующих гидрофильный домен молекулы Саканала . Отрицательно заряженные аминокислотные остатки, которые присутствуют в консервативных гидрофобных последовательностях всех известных изоформ позвоночных и беспозвоночных, показаны в однобуквенном коде. Замена одной из этих аминокислот ЕЛ в трансмембранном домене М2 изоформы 3 приводит к потере чувствительности Саканала к ионам Са2. Замена всего одной из этих аминокислот ЕА в трансмембранном домене М2 приводит к снижению чувствительности изоформы 3 к Са2 в 0 раз . Предполагается, что именно эта аминокислота в каждом из мономеров тетрамерного комплекса участвует в формировании Сасвязывающсго участка с высоким сродством. СКонцсвой участок молекулы также высоко консервативен. Удаление трех Сконцевых аминокислот значительно снижает астивность Саканала изоформы , а удаление всего Сконцевых аминокислот приводит к полной его инактивации всего в состав этой изоформы входит аминокислот, хотя такие молекулы и сохраняют способность формировать тетрамеры . Вероятно, этот участок молекулы необходим для образования функционально активного Саканала. Мутация всего лишь одной аминокислоты 5 в мышечной изоформе свиньи приводит к развитию заболевания, известного под названием злокачественной гипертермии , . У человека это заболевание может быть результатом различных мутаций в двух участках молекулы аминокислотные замены в областях 5 и . При этом заболевании увеличивается чувствительность Саканала к Са2, а стресс у свиней или применение некоторых анестетиков у человека вызывают резкое повышение температуры и могут привести к смертельному исходу . Таким образом, эти участки молекулы также вовлечены в формирование центров связывания Са2. Взаимодействие мышечной изоформы с дигидропиридиновым рецептором ДГПР, необходимое для нормальной передачи конформационного сигнала при электромеханическом сопряжении, обеспечивается участком его молекулы из аминокислот аминокислотные остатки , , . Кроме того, в гидрофильном домене находятся участки связывания нуклеотидов, кофеина, кальмодулина, и других регуляторных белков и низкомолекулярных соединений ii, i, i, vv . Ножка гриба гидрофобный домен , формирующий трансмембранный канал погружена в мембрану СР, а шляпка гидрофильный домен соединяет СР с плазматической мембраной и взаимодействует с ДГПР рис. Такие молекулы формируют в мембране СР правильные ряды, в которых тетрамеры контактируют друг с другом углами своих гидрофильных доменов, что обеспечивает, например, кооперативные взаимодействия между молекулами при связывании 2 ii, i, . Переход Саканалов в открытое состояние сопровождается значительными конформацнонными изменениями, которые затрагивают как гидрофильную, так и гидрофобную части молекулы рис. При этом просвет центрального ионпроводящего канала увеличивается подобно тому, как открывается диафрагма объектива фотоаппарата или расширяется зрачок глаза v . Саканал рианодинового рецептора представляет собой ионселективный канал с необычайно высокой ионной проводимостью для одновалентных приблизительно 0 и 0 с симметричным 0 мМ и 0 мМ К соответственно и двухвалентных примерно в мМ Са2 с стороны катионов. Существование высокой проводимости для Са2 и Ва2 было показано в ряде работ с использованием метода регистрации одиночных каналов при встраивании везикул СР скелетных i . Данный канал был идентифицирован как Саканал на основании его способности активироваться ионами Са2 и адениловыми нуклеотидами и ингибироваться ионами 2 и рутениевым красным. При исследовании свойств очищенных СР скелетных мышц, встроенных в липидные бислои, было установлено, что они обладают высокой проводимостью для Са2 и одновалентных катионов и высокой селективностью по отношению к катионам по сравнению с анионами i .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.195, запросов: 145