Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai

Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai

Автор: Лукашева, Елена Васильевна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2002

Место защиты: Москва

Количество страниц: 226 с. ил

Артикул: 2294438

Автор: Лукашева, Елена Васильевна

Стоимость: 250 руб.

Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai  Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai 

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Часть 1. Оксидазы аминокислот источники, свойства,
применение
1.1 Введение
1.2. Субстратная специфичность оксидаз аминокислот
1.3. Очистка и определение активности оксидаз аминокислот.
1.3.1. Способы очистки.
1.3.2. Способы определения активности
1.4. Физикохимические свойства оксидаз аминокислот
1.4.1. Строение молекулы молярная масса, наличие коферментов и изоэлектрическая точка.
1.4.2. Спектры оптического поглощения
1.4.3. Зависимость скорости ферментативных реакций от
1.4.4. Стабильность оксидаз аминокислот
1.4.5. Ингибиторы оксидаз аминокислот
1.5. Кинетические свойства оксидаз аминокислот.
1.5.1. Стехиометрия реакции
1.5.2. Кинетический механизм ферментативной реакции.
1.6. Применение оксидаз аминокислот в аналитических целях.
1.7. Биологические свойства оксидаз аминокислот
1.7.1. Оксидазы аминокислот, как фактор, вызывающий апоптоз
и агрегацию тромбоцитов.
1.7.2. Изучение биологического действия ЛО i vi
1.7.2. Изучение биологического действия ЛО i viv.
Часть 2. Химические методы иммобилизации ферментов
ГЛАБА 2. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
2.1. Методы определения активности.
2.1.1. Определение активности по скорости накопления перекиси водорода в реакционной среде.
2.1.2. Определение активности ЛО по убыли кислорода в реакционной среде
2.1.3. Определение активности по скорости накопления аммиака в реакционной среде
2.1.4. Определение скорости ферментативной реакции по образованию акетоеамииокапроновой кислоты.
2.1.5. Определение активности по накоплению Апиперидин2 карбоксилата
2.1.6. Определение активности иммобилизованной ПХ
2.1.7. Определение активности иммобилизованной на мембранах
2.1.8. Определение активности совместно иммобилизованных ЛО
2.2. Методы очистки ЛО.
2.3. Методы изучения физикохимических свойств.
2.3.1. Определение концентрации белка
2.3.2. Определение гомогенности препарата, молекулярной массы
и субъединичного состава фермента
2.3.3. Определение изоэлектрической точки
2.3.4. Исследование термостабильности ЛО.
2.3.5. Исследование рНзависимости.
2.3.6. Изучение спектральных характеристик Л О.
2.3.7. Определение числа аминогрупп на поверхности молекулы фермента.
2.3.8. Установление кофактора ЛО.
2.3.9. Определение наличия углеводных компонентов в молекуле
2.4. Методы изучения каталитических свойств
2.4.1. Стехиометрия реакции
2.4.2. Определение Км по отношению к Ьлизину и кислороду
2.4.3. Исследование субстратной специфичности и влияния ингибиторов и активаторов на скорость ферментативной реакции
2.4.4. Изучение влияния модификации некоторых аминокислотных остатков на ферментативную активность
2.5. Иммобилизация Л О
2.5.1. Иммобилизация Л О на силикагеле
2.5.2. Совместная иммобилизация на пористых мембранных носителях Л О и пероксидазы из
2.6. Использование растворимой и иммобилизованной ЛО для определения концентраций Ьлизина.
2.6.1. Определение концентрации Ьлизина с помощью
растворимой ЛО
2.6.2. Использование иммобилизованной на силикагеле ЛО
2.6.3. Использование иммобилизованных на мембранных
носителях Л О и ПХ и субстрата АБТС для определения концентрации Ьлизина.
2.7. Получение растворимых конъюгатов ЛО
2.7.1. Получение неспецифических антител
2.7.2. Исследование активности антител, входящих в состав конъюгатов с ферментами
2.7.3. Получение конъюгатов ЛО с антителами путем окисления углеводного остатка, входящего в молекулу ЛО
2.7.4. Получение конъюгатов ЛО и антител с помощью глутарового альдегида.
2.7.5. Совместная иммобилизация ЛО с ПХ и антителами
2.7.6. Получение конъюгатов Ьлизинаоксидазы с
моноклональными антителами
2.7.7. Изучение физикохимических свойств конъюгатов ЛО с антителами, полученных различными способами.
2.8. Исследование биологических свойств ЛО и ее конъюгатов.
2.8.1. Сравнительное изучение влияния нативной ЛО и Ь
аспарагиназы на рост опухолей.
2.8.2. Исследование цитотоксичсской активности конъюгатов ЛО
с моноклональными антителами 1СО.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ю
3.1. Очистка ЛО.
3.2. Изучение физикохимических свойств фермента
3.2.1. Определение молекулярной массы Ьлизинаоксидазы
3.2.2. Определение изоэлектрической точки. I ц
3.2.3. Исследование зависимости ферментативной активности
3.2.4. Изучение спектральных характеристик Л О
3.2.5. Установление кофермента ЛО
3.2.6. Определение наличия углеводных компонентов в молекуле
3.2.7. Определение числа свободных аминогрупп на поверхности молекулы ЛО
3.2.8. Исследование стабильности ЛО
3.2.9. Зависимость термостабильности ЛО от условий инкубации
и стабильность при хранении
3.2 Температурные изменения конформации ЛО и их роль в регуляции функциональной активности
3.3. Изучение каталитических свойств.
3.3.1. Изучение стехиометрии реакции.
3.3.2. Исследование субстратной специфичности и влияния ингибиторов и активаторов на скорость ферментативной реакции.
3.3.3. Изучение кинетики ферментативной реакции
3.3.4. Изучение влияния модификации некоторых аминокислотных остатков на ферментативную активность
3.4. Иммобилизация ЛО на носителях различного типа.
3.5. Использование растворимой ЛО и ее иммобилизованных препаратов для определения концентрации лизина.
3.6. Изучение влияния нативной ЛО на рост опухолей i viv
3.7. Получение конъюгатов ЛО с антителами и изучение их физикохимических и биологических свойств
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Тот факт, что молочная кислота практически полностью подвергалась превращению, а смесь ее и изомеров превращалась примерно на , свидетельствует о том, что фермент высоко специфичен по отношению к конфигурации агидроксикислот. Фермент действовал на малат и глицериновую кислоту, но в то же время не действовал на соответствующие им аминокислоты аспартат и серии i . Интересным оказалось то, что молочная кислота окислялась в 2,7 раза с большей скоростью, чем ее аналог лейцин. Недавно оксидаза аминокислот была обнаружена в мозге мышей , М, . Авторы полагают, что фермент выполняет, очевидно, важную биологическую роль, осуществляя реакцию окислительного дезаминирования лизина, поскольку в мозге катаболизм лизина осуществляется только через пипеколиновый путь. Оксидаза аминокислот из печени индюка проявляет высокую степень специфичности по отношению к аминокислотам с положительно заряженными боковыми радикалами орнитину, лизину, аргинину, гистидину . Показано, что эти аминокислоты окисляются только по альфааминогруппам. В работе V. С сперматозоидах быка была открыта оксидаза, специфичная по отношению к ароматическим аминокислотам. Свежесобранные эпидермальные шли эякулированные сперматозоиды не обладали активностью по отношению к аминокислотам. Несколько оксидаз аминокислот были выделены из яда различных змей Е. А., i . Наилучшими субстратами для ферментов из этих источников являются изомеры лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина, триптофана, в то время как глицин не является субстратом, а серии, треонин, аспартат, глутамат, лизин, орнитин подвергаются очень медленному дезаминированию Е. А., i . Если экранировать заряд на конце бокового радикала аминокислот, используя еМбензоилЬлизин, цитруллин, еЫкарбобензоксиЬлизин, или карбобензоксиорнитин, то они подвергаются активному воздействию фермента Е. А., i . Кроме того, фермент из змеиного яда катализирует окисление гомоглутамина, соэтиловых эфиров аспарагиновой и глутаминовой кислот, аминоадипиновой кислоты и ряда амидзамещенных производных глутаминовой кислоты, а также нескольких аспартильных и углутамильных пептидов i Т. Т., i . В отличие от оксидаз аминокислот из почек крысы, ферменты из яда змей не атакуют метилированные производные аминокислот метилфенилаланин, метиллейцин, а также пролин, гидроксипролин Е. А. с соавт. Т.Р. Е.В. Этот факт, а также то, что пролин и гидроксипролин являются ингибиторами ферментов из змеиного яда . Однако было обнаружено, что фермент из яда гадюки окисляет 3,4дегидропролин до пиррол2карбоксилата i Н. Асимметричные центры, отличные от аСатома существенно влияют не скорость окисления. Так, изолейцин, окисляется значительно быстрее, чем аллоизолейцин ядом видов змей . Сравнивая специфичность гомогенного фермента яда змеи i со специфичностью грубого экстракта, интересно отметить, что они очень мало отличаются, и это указывает на то, что яд змей, повидимому, не содержит несколько ферментов с различной специфичностью, и что при очистке ничего существенного с ферментом не происходит i Т. Р., Е. В., . Оксидаза аминокислот из яичек шелкопряда действует на широкий спектр субстратов . Ее активность снижается в следующем ряду аминокислот лейцин 0, глицин , аспартат , лизин , глутамат , аланин , валин , цистеин , аргинин . Можно сделать вывод, что скорость окислительного дезаминирования субстратов практически не зависит от природы их бокового радикала, что отличает фермент из этого источника от описанных ранее ферментов. Высокие концентрации субстратов ингибируют ферментативную активность. Так, при концентрации лейцина выше 7 мМ ингибирование становится весьма заметным. В результате действия на орнитин образуется циклический продукт, который можно восстановить до пролина. Фермент из моллюска i . Этот фермент необычно по сравнению с другими оксидазами аминокислот активируется ионами магния. Из i ii , был выделен фермент с широкой субстратной специфичностью, действующий как на основные, так и на гидрофобные аминокислоты, а также на аспарагиновую и глутаминовую кислоты I ii с соавт.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.215, запросов: 145