Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени

Исследование механизмов проникновения вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетку в реальном времени

Автор: Колокольцов, Андрей Алексеевич

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 110 с. ил.

Артикул: 3313745

Автор: Колокольцов, Андрей Алексеевич

Стоимость: 250 руб.

Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эндоцитоз в клетках млекопитающих.
1. 1.1. Фагоцитоз
1.1.2. Клатри изависимый эндоцитоз
1.1.2.1. Основные белки, участвующие в формировании клатриновой ночки
1.1.2.2. Рекрутирование мембранных белков в клатрин покрытые районы
1.1.2.3. iщепление клатрин покрытых пузырьков.
1.1.2.4. Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах
1.1.3. Клатриннсзавнсимый эндоцитоз
1.1.3.1. Липидные рафты
1.1.3.2. Кавеола.
1.1.3.3. Функции кавеолина1.
1.1.3.4. Кавеосомы.
1. 1.4. ГТФазы регуляторы мембранного транспорта
1.1.4.1 ГГФазиый цикл белков
1.1.4.2. Эндосомальные белки.
1. 1.4.2.1. 5 регулятор слияния эндосом.
1.1.4.2.2. 7 и 9 в регуляции поздних эндосом.
1.2.1 роникновение вирусов в клетки.
1.2.1. Клеточная мембрана и вирусные рецепторы.
1.2.2 Клатриизависимый путь проникновения вирусов в клетку
1.2.3. Кавеоларафтзависимое проникновение вирусов
1.2.4. Макропиноцитоз
1.3. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей
1.3.1. Классификация ВЭЛ.
1.3.2. Структура вируса ВВЭЛ и его проникновение в клетку
1.3.3. Выход Альфанирусок из клетки
Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.2. Методы
2.2.1. Культура клеток.
2.2.2. Плазмиды
2.2.2.1. Используемые плазмиды.
2.2.2.2. Получение конструкций, экспрессирующих оболочечные белки ВВЭЛ штаммов ii и .
2.2.2.3. Получение конструкции, кодирующей оболочечный белок вируса i V, слитый с люциферазой
2.2.2.4. Получение лситивирусных экспрессионных векторов, кодирующих факторы ЭНДОЦИТОЗН о пут.
2.2.2.5. Получение конструкций, кодирующих оболочечный белок VV, слитый с люциферазой
2.2.3. Производство пссвдотииированного МЬУ
2.2.4. Производство псевдотипированного лсптивируса
2.2.5. Повышение вирусного титра с помощью бу гирата натрия
2.2.6. Определение вирусного титра.
2.2.7. Нейтрализация вируса антителами.
2.2.8. Использование ингибиторов эндосомального закислсния.
2.2.9. Метод количественного определения слияния вируса с клеткой
2.2 Определение кинетики слияния вируса с клеткой
2.2 Мечение вируса Б метионином
2.2 Анализ экспрессии генов играющих роль в эндоцитозе
2.2 Удаление холестерина.
2.2 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в денату рирующих условиях.
2.2 Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозую мембрану
2.2 Иммунохимичсский анализ белков.
2.2 Статистическая обработ ка данных.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Количественная оценка проникновения вируса в реальном времени.
3.1.1. Неспецифическое включение фермента дюциферазы в пироплазму
3.1.2. Специфическое включение люциферазы в вироплазму с помощью слияния с обол очечным белком
3.1.3. Сравнение целост ности полученных вирусных частиц.
3.1.4. Исследование специфичности полученных вирусных частиц на клетках, не содержащих вирусный рецептор.
3.1.5. Исследование влияния Т1Р мутации па слияние вирусных частице клеткой
3.1.6. Оценка эффекта ингибиторов в используемой модели слияния.
3.2. Получение МЬУ векторов с ВВЭЛ оболочечными белками и их
характеристика.
3.2.1. Исследование экспрессии и включения оболочечпых белков ВВЭЛ в вирусную частицу
3.2.2. Определение инфекшюнности полученных псевдотипов ВВЭЛ.
3.2.4. Нейтрализация пссвдотипов с помощью ВВЭЛ реактивной сыворотки.
3.2.5. Ингибирование инфекции с помощью ли юсомотропных аг ентов.
3.2.6. Получение лентниирусных векторов с ВВЭЛ оболочечными белками
3.2.7. Определение диапазона клеток, инфицируемых исевдотипом
3.3 Слияние альфавирусов с клеточной мембраной.
3.3.1. Включение фермента люциферазы в ВВЭЛ псевдотип
3.3.2. Определение целостности полученною вируса.
3.3.3. Определение кинетики проникновения вируса.
3.3.4 Исследование эффекта нейтрализующих антител на проникновение ВВЭЛ псевдотипа.
3.3.5. Влияние ингибиторов жчосомального такислеиия на проникновение вируса
3.3.6. Экспрессия и ГАСБ аиалич белков, участвующих в эндоциточе.
3.3.7. Влияние Ер ЕД5 на поглощение трансферрина и проникновение вируса.
3.3.8. Роль ранних и поздних эндосом в проникновении ВЭЛ.
3.3.9. Зависимость проникновения псевдотипа ВВЭЛ от холестерина
Заключение.
Выводы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
3 НЕК эмбриональные клетки почки человека АР адапторный белок СОХ2 циклооксигсназа
I 4,6iii2Ii специфичный для ДНК краситель
вирус Обола
эпидермальный фактор роста
рецептор эпидермального фактора роста
эндотелиальная сит i аза оксида азота
v оболочечный белок вируса
v оболочечный белок вируса, слитый с люцнферазой
субстрат пути рецептора клон
i белок, взаимодействующий с
ЕЕ ранние эндосомы
эндоплазмати чески й ретикулум
проточная цитометрия
эмбриональная тсляч1я сыворотка
кристал и зуемый фрагмент ан ти тела
ГТФачу активирующий белок
I ГДФ ингибитор диссоциации
зеленый флюоресцирующий белок
2 клетки гематомы человека
I иммуноглобулин
I имунная преципитация
лииоиротеины низкой плотности
длинные концевые повторы
люцифераза
V вирус лейкоза мышей
I множественность заражения
фосфатный солевой буфер
РКА протеин киназа А
протеин киназа С
0 перинуклеарные эндосомы возвращения
сопровождающий белок
V вирус долины реки Росс додецилсульфат натрия V вирус леса Семлики ii вирус Синдбис рецептор трансферрииа
3I рецептор трансформирующего розового фактора
ГМ трансмембранный фрагмент
V вирусный белок
VV Вирус Везикулярного Стоматита
галактозидаза
БСА бычий сывороточный альбумин
ВВЭЛ Вирус Венесуэльского Энцефаломиелита Лошадей
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ВЭЛ Венесуэльский Энцефаломиелит Лошадей
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
к.ф.е. колонию формирующая единица
ЛНЛ соотношение люциферазной активное и лизированного вируса к актвности нелизированиого
о.е.с. относительная единица свет п.н. пара нуклеотидов НЦР полимеразная цепная реакция эти лен диамии ii раацетаг
ВВЕДЕНИЕ


Другой метод основан на присоединении фермента рлактомазы к V белку вируса иммунодефицита человека vi . ВИЧ частицы во время сборки вируса. Это обеспечивает попадание фермента во внутрь частицы, который высвобождается в клетку после слияния вируса. Для уменьшения времени необходимо от до 0 инфекционных частиц на клетку, что не является физиологичным. Таким образом, задача количественною определения вирусных частиц в клеткехозяине после инфицирования остается нерешенной. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей ВВЭЛ входит в состав семейства Тогавирусов. Наши знания об альфавирусах получены в основном при исследованиях ii и ii вирусов, в то время как мало известно о высоко вирулентном ВВЭЛ, особенно о его проникновении в клетку. Так как существует много примеров, когда родственные вирусы используют разные мути проникновения, так. К тому же было предположено, что аминокислотные различия в оболочечных белках ВВЭЛ и V определяют зависимость слияния от содержания холестерина в мембране, но это никогда не было проверено на клетках млекопитающих. Для оболочечных вирусов, оболочечные белки вируса связываются со специфичными клеточными рецепторами и определяют клеточный тропизм и путь проникновения в клетки. В настоящее время общепринято, что псевдотипы используют механизм проникновения и путь донора оболочечных белков, но не реплицируются, что позволяет изучать проникновение в клетки опасных вирусов в лабораториях с низким уровнем защиты. Использование хорошо изученных псевдотипов VV р Iзависимый вирус, использует клатринзависимый эндоцитоз и V независимый вирус, не нуждается в эндоцитозс и сливается с плазматической мембраной, позволяет оптимизировать метод измерения проникновения вируса и проверить метод на пригодность и чувствительность. Целью настоящей работы было изучение условий проникновения вируса ВЭЛ в клетки 3 НЕК человека. Подобрать способ включения в вирусную частицу люциферазы, как наиболее подходящего фермента для определения слияния вируса. Проверить разработанный метод на псевдотипах VV и V. Получить псевдотип ВВЭЛ и проверить его функциональность. Адаптировать разработанный метод к ВВЭЛ псевдотипу. На основании анализа люциферазной активности определить значение мембранного холестерина и ранних и поздних эидосом при проникновении ВВЭЛ в клетки. В работе впервые разработан метод специфичного включения фермента люциферазы в вирусную частицу. Было показано, что модифицированный вирус функционален, а люцифераза находится внутри вируса и защищена от контакта с субстратом вирусной мембраной, поэтому фермент может получить доступ к субстрату только после слияния вируса с клеткой. Впервые разработан метод наблюдения проникновения вируса в клетку в реальном времени. Показано, что связывание вируса является рецептор специфичным, так как положительный сигнал был получен только на клетках, экспрессирующих рецептор. Использование ингибиторов эндосомал иного закисления доказало пригодность разработанного метода для изучения эффекта ингибиторов на проникновение вирусов, причем эффект специфичен для каждого псевдотипа тестируемого вируса и зависит от используемого оболочечиого белка. Впервые получен ВВЭЛ псевдотип. ВВЭЛ. Таким образом, псевдотип повторяет путь проникновения вируса дикого типа, что позволяет использовать его для определения факторов, необходимых для проникновения в клетки ВВЭЛ дикого типа. В результате данного исследования показана необходимость наличия функциональных поздних эндосом для эффективного проникновения ВВЭЛ в клетки, а также независимость проникновения ВВЭЛ от мембранного холестерина. Результаты, полученные при изучении способов проникновения вируса ВЭЛ в клетку хозяина, имеют существенное значение для фундаментальной науки. Исследование механизмов транспорта вирусных частиц через клеточную мембрану важно для современной биохимии, изучающей мембранный транспорт. Эта проблема позволяет также подойти к пониманию механизмов инфицирования, что важно для изучения природы самого вируса п вирусного патогенеза. Так.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.209, запросов: 145