Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков

Использование методов геносистематики для изучения видового состава и метаболического потенциала микроорганизмов-деструкторов ароматических ксенобиотиков

Автор: Хоменков, Василий Григорьевич

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Москва

Количество страниц: 135 с. ил.

Артикул: 2772852

Автор: Хоменков, Василий Григорьевич

Стоимость: 250 руб.

1. Гены пути .метарасщепления ароматического кольца.
1.1 Экстрадиольныедиоксигеназы
2. Гены пути оторасщепления ароматического кольца
2.1 Гены модифицированных ортопутей
2.2 Интрадиольные диоксигеназы
Нижние пути
3. Гены периферических нижних ферментов метаболических путей
3.1 Диоксигеназы многокомпонентных ароматических колец
3.2 Монооксигеназы
З.ЗДегалогеназы.
4. Регуляторные гены. Транскрипционная регуляция метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков.
5. Механизмы генетической адаптации микроорганизмов к утилизации ароматических ксенобиотиков
5.1 Перенос генов.
5.2 Точечные мутации
5.3 Геномные перестройки
5.4 Дупликация генов
5.5 Транспозиции
5.6 Инсерционная активация
6. Основные подходы и методы молекулярной систематики, филогении для идентификации микроорганизмов и микробных сообществ.
П. Материалы и методы.
1. Культивирование, отбор и адаптация бактериальных культур.
2. Выделение геномной ДНК изучаемых культур
3. Методика ПЦРклонирования Бр ДНК последовательностей из тотальной ДНК культур.
4. Разделение гетерогенных ПЦРпродуктов путем молекулярного клонирования в векторную систему рСЕМТЕаэу.
5. Клонирование ПЦРпродуктов генов ключевых ферментов путей утилизации ЛОС из тотальной ДНК культур
6. Штаммыреципиенты, использованные при клонировании
7. ПДРФанализ плазмидных клонов л продуктов ПЦР
8. Измерение удельной активности типированных диоксигеназ.
Ш. Результаты и их обсуждение
1. Выделение и адаптация культур микроорганизмовдеструкторов к утилизации различных ксенобиотиков.
2. Формирование выборки клонов и ПДРФанализ полученных конструкций
с последовательностями 5рДНК.
3. Анализ последовательностей отобранных клонов и восстановление видового состава консорциумов. Доминантные и минорные компоненты консор
циумов. Изучение таксономического положения вновь охарактеризованных по последовательности рДНК доминантных культур консорциумов
4. ПЦРклонирование генов ключевых ферментов, ответственных за утилизацию ЛОС по орто и метапути. Сравнительная характеристика нуклеотидных последовательностей обнаруженных генов и их соотнесение с соответствующими консорциумами
5. Изучение специфической активности диоксигеназ исследуемых культурах
IV. Выводы
V. Список использованных источников
Х Приложение
Введение
В условиях постоянно возрастающих объемов промышленного и сельскохозяйственного производства, все большую актуальность приобретают вопросы защиты окружающей среды и, в частности, атмосферы от разнообразных техногенных загрязнителей. Основной вклад в промышленное загрязнение воздуха вносят предприятия химической, целлюлознобумажной, лакокрасочной и пищевой промышленности, сельскохозяйственные и перерабатывающие предприятия, комплексы интенсивного животноводства, предприятия, осуществляющие очистку сточных вод и обезвреживание отходов. Промышленные предприятия являются источниками выбросов в атмосферу токсичных и пахучих веществ, которые даже в небольших концентрациях вызывают у людей чувство дискомфорта, создают угрозу жизни и здоровью.
В последнее время для очистки индустриальных вентиляционных выбросов, содержащих летучие органические соединения, все шире применяются микробиологические методы, появившиеся в связи с интенсивным развитием промышленной биотехнологии.
Действие микробиологических воздушных фильтров основано на деструкции органических субстратов микроорганизмами, приводящей, в конечном итоге, к образованию продуктов терминальной минерализации СО2 и воды. В отличие от методов химического окисления каталитического, плазменного и обычного сжигания при работе микробиологических фильтров не образуется окислов серы и азота, хлора и других экологически опасных веществ. В отличие от адсорбции и фильтрования через селективные мембраны, эксплуатация микробиологических фильтров не ведет к образованию и накоплению отработанных мембран и сорбентов, загрязненных удалявшимися из воздуха продуктами. Биофильтры эффективны, не загрязняют окружающую среду, просты в эксплуатации, поэтому могут широко использоваться в технологических процессах утилизации основного объема промышленных и бытовых органических загрязнителей.
Широкое применение микробиологической очистки воздушных выбросов в промышленных условиях нуждается в современных методах мониторинга состояния работающих систем, а также выявления и характеристики процессов и механизмов организации микробных сообществ внутри работающих биофильтров. Методы микробиологической идентификации и типирования культур, не утрачивая своей актуальности, в настоящее время уже не могут обеспечить достаточную точность и быстроту анализа.
Развитие молекулярных методов идентификации микроорганизмов и их применение в таксономии и экологии позволяет наиболее адекватно применять методы геносистематики
и молекулярной биологии на практике при анализе природных и промышленных микробных сообществ.
Основное достоинство молекулярногенетических методов типирования бактериальных культур заключается в возможности предварительной видовой идентификации микроорганизмов непосредственно в составе различных консорциумов с получением статистически достоверных данных о количественном и качественном составе таких консорциумов.
Пели и залячи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение, отбор и адаптация новых культурдеструкторов различных ароматических ксенобиотиков, определение их видовой принадлежности и отличительных характеристик с использованием методов геносистематики и молекулярной биологии, а также оценка их метаболического потенциала в отношении ряда ароматических ксенобиотиков.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
1. Отобрать новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации следующих Л ОС толуол, стирол, этил бензол, о и мксилол, нафталин
2. Молекулярнобиологическими и микробиологическими методами качественно и количественно охарактеризовать состав микробных культур и консорциумов, способных успешно утилизировать указанные ЛОС в лабораторных условиях.
3. Обнаружить и охарактеризовать последовательности генов ключевых ферментов метаболизма ЛОС в геноме изучаемых культур.
4. Изучить специфическую активность обнаруженных ключевых ферментов у охарактеризованных культур
I. Литературный обзор
Введение


Наиболее значимые ферменты пути метарасщепления кодируются генами x, x, x, x, x, x, x, и x, которые в указанном порядке располагаются в 5концевой части метаоперона. Катаболические гены плазмиды 7, необходимые для деградации нафталина через салицилат 9, кластеризованы в двух оперонах и 9, 9. Оперон содержит в своем составе те же гены пути . I из различных источников показало их практически полную идентичность , . Эти данные были подтверждены также рестрикционным картированием в сочетании с гибридизацией по Саузерну 8, 6. Гены и , родственные хуП и x, были идентифицированы в специализированных оперонах , обусловливающих способность к деградации толуола, хотя в данном опсроне они не расположены рядом, а отделены друг от друга генами диоксигеназы ароматического кольца и 3метил2,3диоксигеназы . Другой вариант метапути был описан у штамма . Данный метапуть расщепления кодируется кластером генов I в составе плазмиды VI0. Это было доказано в результате изучения физикохимических свойств продуктов данных генов и их концевого секвенирования по Эдману, а также при сопоставлении нуклеотидных последовательностей. При сравнительном анализе полученных последовательностей было установлено также, что кластер генов нижних путей из плазмиды VI0, гомологичен генам метапути расщепления хуоперона 6. Также известно, что гены метапути расщепления, локализованные на плазмиде VI0, образуют один оперон вместе с генами , кодирующими фенолгидроксилазу. I 2 и 3метилкатехол2,3диоксигеназой продукт из . К ним относятся катехол2,3диоксигеназа из i 2 и протокатехоат4,5диоксигеназа из Р. Ортопутъ расщепления ароматического кольца может начинаться как с катехола, так и с катехоата в качестве начального субстрата. В клетках бактерий оба эти соединения преобразуются в общий интермедиат Зоксоадипатеноллактон, который затем превращается в сукцинат и ацетилКоА. Ортопутъ ращепления можно рассмотреть на примере схемы химических реакций превращения бензоата и пгидроксибензоата. Ь муконатциклоизомераза или лактонизирующий фермент За и ЗЬ декарбоксилаза 4а или муконолактонизомераза 4Ь еноллактонгидроксилаза 5а и 5Ь и трансфсраза и тиолаза. ТСА на схеме 2 цикл трикарбоновых кислот. Гены, кодирующие ферменты пути расщепления схема 2, локализованы на бактериальной хромосоме 4, , , 3, 6, 7. Например, у некоторых микроорганизмов, таких как i i, существует два набора ферментов для деградации 3оксоадипатеноллактона, кодируемых различными генами и . В то время как у . Гены модифицированных ортопутей
При исследовании ряда бактериальных штаммов, способных к деградации хлорированных ароматических соединений, таких как хлорбензол , 8, 0, 7, 9, 0, хлорбензоат , , , , 9 и 2,4дихлорфеноксиуксусная кислота , , 5, было установлено существование в природе приниципиально нового набора ферментов ортопути расщепления ароматических соединений. Большинство этих штаммов превращает хлорированные ароматические соединения в хлорзамещенные катехолы, которые затем, как правило, расщепляются в ортоположении хлорокатехол1,2диоксигеназой. Ферменты, участвующие в минерализации хлорокатехолов, имеют более широкую субстратную специфичность, чем типичные ферменты ортопут расщепления. Именно поэтому пути деградации хлоркатехолов называются также модифицированным путем орто расщепления. У штамма . В , , 9, 1, 4, 5, 2, у i 4 , 8, 5, 1, 2, 1, 3, 9 и у других бактерий, метабол изирующих хлорированные бензолы , 9,8,1, 8, 0, 0, эти пути были детально охарактеризованы схема 3. В противоположность обычным генам ортопути расщепления, гены модифицированных путей орторасщепления в основном локализованы на катаболических плазмидах , , , , , 0, 9, 7, причем состав этих оперонов существенно отличается от хромосомных аналогов, содержащих, например, гены групп и рса. Гены модифицированного пути орторасщепления из трех бактерий были картированы и охарактеризованы i i рАС , , , , оперон из . Р рР 7, 0. В этих трех организмах гены хлоркатехол1,2диоксигеназы совмещены с генами основного пути в составе единого оперона. Гены хлоркатехол1,2диоксигеназы и хлороцикпоизомеразы этих оперонов гомологичны генам обычного пути орторасщепления , 5, 7.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.277, запросов: 145