Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой

Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой

Автор: Чурюмова, Валерия Александровна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2008

Место защиты: Москва

Количество страниц: 169 с.

Артикул: 4240999

Автор: Чурюмова, Валерия Александровна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Родопсинкиназа представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряженных с Обелками
1. Общая схема зрительной трансдукции.
1.1. Передача зрительного сигнала.
1.2. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки .
2. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряженных с Обелками
2.1. Тканевая и внутриклеточная локализация.
2.2. Организация генов семейства ОЮС
2.3. Структурные особенности протеинкиназ семейства ОЮС
2.3.1. Характеристика доменов.
2.3.2. Посттраисляционные модификации.
2.3.3. Кристаллические структуры представителей семейства ОЮС.
2.4. Регуляция ОЮС
2.4.1. Регуляция активности ОЮС при участии Са связывающих белков
2.4.2. Регуляция активности и клеточная локализация.
2.4.3. Фосфорилирование ОЮС другими протеинкиназами.
2.4.4. Взаимодействие вЛК с кавеолином и другими лигандами
2.4.5. Регуляция экспрессии ОЮС.
2.4.6. Аутофосфорилирование ОЮС.
2.5. Регуляция рецепторов независимо от их фосфорилирования под действием ОЮС.
2.6. Физиологическая роль протеинкиназ семейства ОЮС и их участие в патологических процессах
3. Десенситизация родопсина путем фосфорилирования
родопсинкиназой.
3.1. Механизм фосфорилирования родопсина родопсинкиназой
3.2. Фосфорилирование родопсина с высоким выходом
3.3. Сазависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Выделение плазмидной ДИК из клеток штамма Е.соП ХЬ2.
3. Получение генетических конструкций, кодирующих химерные белки ТИ и вБТС
4. Приготовление компетентных клеток.
5. Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК.
6. Отбор мутантных клонов
7. Секвенирование ДНК
8. Экспрессия гена вБТ, выделение и очистка рекомбинантного белка
9. Экспрессия генов ТЫ и ОБТС, выделение и очистка химерных белков.
. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН.
. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм.
. Приготовление кальциевых буферов и измерение Са г
. Определение количества кальция, связанного с рековерином.
. Взаимодействие рековерина с фенилсефарозой.
. Выделение НСП
. Выделение рафтструктур из мембран НСП.
. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран
. Приготовление липосом
. Изменение содержания холестерина в мембранах НСП.
. Связывание рекомбинантного рековерина с отмытыми мочевиной мембранами НСП и искусственными фосфолипидными везикулами.
. Выделение родопсинкиназы
. Определение активности родопсинкиназы.
. спектроскопия
.1. Иммобилизация липосом.
.2. Измерение связывания рековерина с чипом и обработка экспериментальных данных
. Связывание рекомбинантных белков , и С с рековерином.
. Изучение влияния пептидных фрагментов родопсинкиназы на связывание концевого домена родопсинкиназы с рековерином
. Аналитические процедуры.
.1. Электрофорез ДИК в агарозном геле.
.2. электрофорез в полиакриламидном геле
.3. Определение концентрации белков .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию
фосфорилирования родопсина
1.1. Исследование влияния холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами.
1.2. Влияние содержания холестерина на Сарековеринзависимую регуляцию фосфорилирования родопсина.
2. Исследование роли Са связывающих центров рековерина в ингибировании родопсинкиназы.
2.1. Исследование роли Са связывающих центров рековерина в экспонировании гидрофобного кармана.4.
2.2. Исследование роли Са2связывающих центров рековерина в
ингибировании родопсинкиназы
3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за взаимодействие с рековерином
3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы.
3.2. Клонирование, экспрессия и выделение 1 и Сконцевых доменов родопсинкиназы
3.3. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за
взаимодействие с рековерином
СИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИПТГ изопропилтиорБгалактозид
К полу максимальная константа ингибирования
НСП наружные сегменты палочек сетчатки
ПЦР полимеразная цепная реакция
Та, ТР, Ту а, Р, усубъединицы трансдуцина
ФДЭа, ФДЭр, а, р, усубъсдиницы цГМФ
ФДЭу фосфодиэстеразы
ЭГТА бис2аминоэтиловый эфир этиленгликоль
i кислоты 2 концентрация свободного Са
СаМ кальмодулин
2 2й Са связывающий центр рековерина
3 3й Са связывающий центр рековерина
, 3 а и русубъединицы белка
рецепторы, сопряженные с белками
семейство протеинкнназ рецепторов, сопря
женных с белками глутатион трансфераза
и концевой и Сконцсвой домены родопсин
киназы, соединенные с глутатион
трансферазой
семейство нейрональных Са2сенсоров
фосфатидилхолин
РЕ фосфатидилэтаноламин
Р1Рг фосфатидилинозит4,5дифосфат
РКА, РКВ, РКС протеинкиназы А, В и С
,


и

спектроскопия
нТрековернн
мутант рековерина с аминокислотной заменой в
мутант рековерина с аминокислотной заменой 1 в
регуляторы белков i ii
фотовозбужднный родопсин фосфорилированный фосфорилированный темновой родопсин концевой и Сконцевой домены родопсинкиназы
додецилсульфат натрия
спектроскопия поверхностного плазмон
резонанса ,
рековерин дикого типа
ВВЕДЕНИЕ


Наружный сегмент палочки НСП в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как внячивание плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет ведет свое происхождение от внеклеточного пространства 1,2. СВЕТ
На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего 4, 5. Около общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок родопсин 6. Только два белка присутствуют в количестве, превышающем 1 копию на 0 молекул родопсина, эго трансдуцин и аррестии. Еще белков, включая цГМФфосфодиэстеразу, представлены 1 копиями на молекул родопсина. Молярное соотношение фосфодиэстераза трансдуцин родопсин выглядит как 1 0 7. Свет, воздействуя на зрительный пигмент родопсин, переводит его в фотовозбужденное состояние , и далее сигнал передатся от к цГМФзависимым катионным каналам, локализованным в плазматической мембране фоторецепторной клетки. Передача сигнала от к катионным каналам опосредуется фосфодиэстеразным каскадом, последовательность событий в котором имеет следующий вид светозависимая активация родопсина ГДФГТФобмен на трансдуцине активация цГМФфосфодиэстеразы падение внутриклеточной концентрации фоторецепторного вторичного мессенжера цГМФ закрывание катионных каналов и гииерполяризация плазматической мембраны НСП рис. Далее зрительный сигнал передается через нейроны высшего порядка и по зрительному нерву в соответствующие отделы головного мозга 1,2. Родопсин. Поглощение кванта света родопсином, трансмембранным зрительным рецептором, и переход этого белка в фотоактивированное состояние начальный этап процесса трансдукции зрительного сигнала. Родопсин представля собой гликопротеин с молекулярной массой около кДа, который состоит из 8 аминокислотных остатков 8 и хромофорной группы, гмсретиналя 9. На основании консерватизма структуры и функций родопсин относят к крупнейшему семейству рецепторов, сопряженных с белками i , , или ТМ7рецепторы . Во внутридисковое пространство экспонирован концевой фрагмен т молекулы родопсина, к которому присоединены две углеводные цепи, ковалентно связанные с боковой группой 2 и . Ч . Рис. Общая схема молекулярных механизмов зрительной трансдукцин. Т трансдуцин цГМФфосфодиэстераза . Агг аррестин трансдуцин. Участки полипептидной цепи родопсина, выходящие из мембраны в цитоплазму НСП, содержат гидрофильные аминокислоты и представлены тремя петлями, соединяющими I, IIIV и VVI трансмембранные аспирали, и Сконцевым фрагментом, состоящим приблизительно из аминокислотных остатков. Шиффа с аминогруппой боковой цепи остатка 6 в седьмой трансмембранной аспирали белка. Сконцевого участка родопсина в мембране 9, . Поглощение родопсином кванта света приводит к его фотолизу ряду фотохимических превращений, конечными продуктами которых являются полностьюшрянсретиналь и опсин. Наибольшую важность для возникновения фоторецепторного ответа представляет один из интермедиатов фотолиза родопсина метародопсин II, появление которого при комнатной температуре наблюдается примерно через сек после поглощения родопсином кванта света . Как и другие представители , родопсин способен к олигомеризации. В ряде исследований с применением различных видов микроскопии показано, что родопсин в мембране НСП может существовать в виде димеров. Авторы предполагают, что это свойство важно для функционирования рецептора, в частности, для его взаимодействия с другими участниками зрительного каскада . Грансдуцип. Метародопсин II выступает в роли активатора следующего белка зрительного каскада, белка трансдуцина, молекула которого состоит из трех различных субъединиц а, Р и у с молекулярными массами , и 8 кДа, соответственно .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.198, запросов: 145