Идентификация клеточного олигонуклеотид-связывающего белка Р38 и его взаимодействие с нуклеиновыми кислотами

Идентификация клеточного олигонуклеотид-связывающего белка Р38 и его взаимодействие с нуклеиновыми кислотами

Автор: Брыксин, Антон Вячеславович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 140 с. ил.

Артикул: 3320897

Автор: Брыксин, Антон Вячеславович

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Малые нуклеиновые кислоты как регуляторы экспрессии генов НММ1МИННМИИМНИИМНЖ
1.1.1 Ангисмысловые олигонуклеотиды Рациональный подход.
1.1.1.1 Влияние олигонуклеотидов основанное на конкуренции с нуклеиновыми кислотами
Подавление транскрипции
Подавление сплайсинга
Подавление трансляции.
Изменение структуры РНК
1.1.1.2 Активация РНКазы Н.
1.1. РНК интерференция
1.1.2 Нуклеиновые аптамеры Иррациональный подход
1.1.3 Механизмы проникновения малых нуклеиновых кислот в клетки.
1.1.3.1 Жидкофазный эндоцитоз
1.1.3.2 Рецепторопосредованный эндоцитоз
1.1.4 Распределение олигонуклеотидов внутри клетки .
Гл ицерал ьдегид3фосфат дегидрогеназа
1.2.1 Структура фермента
1.2.2 Участие вАРИН в слиянии клеточных мембран, взаимодействии с микротрубочками и
везикулярном транспорте.
3 Взаимодействие САРИН с нуклеиновыми кислотами.
.3.1 б АРИН ДНКРНКсвязывающнй белок физикохимические характеристики
взаимодействия б АРИН с нуклеиновыми кислотами .
1.2.3.2 Модификации и полимерные структуры САРИН и их роль во взаимодействии
фермента с нуклеиновыми кислотами.
Сайт САРИН, ответственный за связывание нуклеиновых кислот.
1.2.3.4 Влияние взаимодействия САРИН с нуклеиновыми кислотами на оксидоредуктазную
активность фермента.
1.2.3.5 Функциональная роль взаимодействия САРИН с нуклеиновыми кислотами.
Транспортная функция .
регулятор транскрипции.
Защита нуклеиновых кислот от гидролиза.
катализатор активности рибозимов.
и патогенез РНКсодержащих вирусов.
Хеликазные свойства
Участие в поддержке структуры теломер
и репарация ДНК
1.2.4 и клеточный апоптоз. Взаимодействие с i протеазой
3 Заключение
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Реактивы н материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Олигонуклеотиды.
2.1.3 Ферменты
2.1.4 Клеточные линии, использовавшиеся в работе, и условия их культивирования
2.1.5 Буферы, среды и основные стоковые растворы
Методы МШММММММНМММММН1ММММММММНМММвИВМИМММНММММНМНММНН1И1ММММНММаММ
2.2.1 Электрофорез олигонуклеотидов, белков, ДНК
1 Определение концентрации белка
2.2.3 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов
2.2.4 Получение и очистка Рмеченных олигонуклеотидов.
2.2.5 Синтез модифицированных олигонуклеотидов
2.2.6 Приготовление ядерного экстракта клеток
.7 Определение молекулярной массы белков.
2.2.8 Приготовление компетентных клеток . i .
2.2.9 Подготовка плазмиды i Ii для прямого клонирования ПЦР продуктов.
2.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток . i.
2.2. Активация улирагеля А2 бромцианом
2.2. Приготовление слайдов и микроскопия
. Получение клеточных фракций. Анализ распределения олигонуклеотидсвязывающих
белков по фракциям .
2.2. Ступенчатое сульфатаммонийное фракционирование белков ядерного экстракта
2.2. Аффинная хроматография олигонуклеотидсвязывающих белков.
2.2. Выделение глицеральдегид3фосфат дегидрогеназы из эритроцитов человека
2.2. Исследование стабильности олигонуклеотидного производного I и Ii6.
2.2. Определение величин констант диссоциации Ка олигонуклеотидбелковых комплексов
2.2. Исследование влияния потенциальных конкурентов различной природы на
взаимодействие глицеральдегид3фосфат дегидрогеназы с олигонуклеотидами
2.2. Исследование влияния олигонуклеотидов на оксидоредуктазную активность
глицеральдегид3фосфат дегидрогеназы.
2.2. Исследование олигонуклеотидсвязывающего центра глицеральдегид3фосфат
дегидрогеназы.
2.2. Определение урацилДНКгликозилазной активности препарата
2.2. ПЦРсплайсинг гена человека
2.2. Клонирование и экспрессия гена человека в . i
2.2. Выделение рекомбинантного препарата глицеральдегид3фосфат дегидрогеназы
человека из клеток . i
2.2. Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к методом
молекулярной селекции
2.1 Получение и характеризация поликлональных антител кролика против .
2.2. Выделение пула антител, специфически взаимодействующих с .
2.9 Иммунопреципитация комплекса олигонуклеотид антителами против из
ядерного экстракта клеток
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Исследование олигонуклеотидсвязывающего белка р клеток линии 1нммннмжи
3.1.1 Модификация белков ядерного экстракта алкнлирующимн производными
олигонуклеотидов различных последовательностей
3. Исследование внутриклеточного распределения р в клетках линий , А1 и .
3.1.3 Определение константы диссоциации олигонуклеотидбелкового комплекса.
3.2 Выделение и идентификация олигонуклеотидсвязывающего белка
3.2.1 Выделение р из ядерного экстракта клеток линии
3.2.1.1 Ступенчатое сульфатаммонийное фракционирование ядерного экстракта клеток
линии .
3.2. Аффинная хроматография.
.2 Определение первичной структуры р.
3 Исследование олнгонуклеотндсвязывающих свойств глицеральдегид3фосфат
дегидрогеназы
3.3.1 клеточный белок р, участвующий в селективной доставке олигонуклеотида
в ядра клеток.
3. Изучение олигонуклеотидсвязывающего центра . Влияние взаимодействия
нуклеиновых кислот с на ей ферментативную активность.
3.3.2.1 Изучение влияния потенциальных конкурентов различной природы на взаимодействие
с олигонуклеотидами.
3.3.2.2 Влияние ДНК и РНК на ферментативную активность .
3.3.2.3 Локализация сайта, ответственного за связывание с олигонуклеотидами,
методом пептидного гидролиза
3.3.3 Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к методом молекулярной селекции
3.3.3.1 ПЦРсплайсинг гена .
3.3.3.2 Клонирование и экспрессия гена человека в . i
3.3.3.3 Молекулярная селекция .
3.3.3.4 Определение величины комплекса с олигонуклеотидом
3.3.4 Сравнительное исследование распределения и комплекса олигонуклеотид между ядром и цитоплазмой клеток линий А1, и
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Фермент, так же как и кодирующий его ген, представлен во многих научных работах и учебниках как образец понимания механизма ферментативной реакции, организации структуры гена и регуляции его экспрессии. Интересно, что является очень консервативным бежом, медленно меняющемся в ходе эволюции. Так, разница между бежом человека и . Столь высокая степень консервативности может свидетельствовать о том, что помимо гликолиза, возможно выполняет другие функции в клетке. Действительно, на протяжении последних трех десятилетий было показано участие белка во многих клеточных процессах, зачастую не связанных с гликолизом, таких как, например, ядерный экспорт 8,9, фосфотрансферазная активность , участие в репликации и репарации ДНК ,, регуляция экспрессии генов гистонов , участие в процессе слияния ядерных мембран и сборке микротрубочек . Было также обнаружено, что при определенных условиях в значительных количествах перемещается в ядро клетки. Более того, может эффективно связываться с нуклеиновыми кислотами, и такое взаимодействие, повидимому, играет немаловажную роль в функционировании клетки ,. В настоящей работе дана оценка эффективности такого взаимодействия, определен участок фермента, ответственный за связывание нуклеиновых кислот, а так же оценено влияние взаимодействия на оксидоредуктазную активность фермента. Использование генноинженерного препарата и метода молекулярной селекции, позволило установить последовательность одноцепочечной ДНК, наиболее эффективно взаимодействующая с ферментом. В клеточной системе показано, что комплексы оцДНК эффективно транспортируются в ядра клеток. Целью настоящей работы являлась идентификация клеточного олигонуклеотидсвязывающего бежа р и исследование его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. Выделить и идентифицировать олигонуклеотидсвязывающий белок р клеток человека. Определить специфичность связывания р с олигонуклеотидами определенной последовательности, поиск нуклеотидного мотива сайта связывания белка. Локализовать олигонуклеотидсвязывающий домен р. Получить антитела против р и с их помощью исследовать локализацию белка в клетке и роль в транспорте нуклеиновых кислот. К настоящему времени использование антисмысловых нуклеиновых кислот для взаимодействия с мРНК и селективного подавления экспрессии определенных генов стало стандартной лабораторной и, в некоторых случаях, врачебной практикой ,. На протяжении последнего десятилетия было разработано множество модификаций антисмысловых технологий, которые можно разделить по типу их действия на ферментзависимые и независимые. Ферментнезависимые подходы используют олигонуклеотиды с различными включениями, которые создают стерические, либо конкурентные препятствия на пути ферментов, принимающих участие в процессах транскрипции и трансляции и включают в себя 2Ча1ку1 производные , пептидные нуклеиновые кислоты РИА, закрытые нуклеиновые кислоты ЬКА а также морфолиновые производные олигонуклеотидов . Ферментзависимые подходы, в свою очередь, можно разделить на РНКазаНзависимые использующие одноцепочечные ДНК, РНК а так же их фосфоротиоатные модификации для активации РНКазыН и последующей деградации мРНКмишни, и ЯКСзависимые РНКзависимый комплекс репрессии использующие в своей основе двухцепочечные РНК, которые деградируют мРНКмишни по РНКи Ю4Азависимому пути . Следует отметить, что клетки могут сами синтезировать такие антисмысловые молекулы РНК для регуляции экспрессии определенных генов . Несколько в стороне от описанных выше антисмысловых или рациональных подходов находится ингибирование олигонуклеотидами специфической функции белка путем прямого взаимодействия с последним. Такой подход является ферментнезависимым, хотя его никак нельзя назвать антисмысловым. Обнаруженный изначально как неспецифический механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов, он находит все более широкое применение в сочетании с методом молекулярной селекции для создания олигонуклеотидов, специфически ингибирующих ферментативную активность одного белка . Такой комбинаторный подход, вероятно, найдет свое применение при лечении определенных заболеваний в будущем. Некоторые из перспективных разработок на основе аптамеров проходят в настоящее время клинические испытания .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.705, запросов: 145