Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой

Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой

Автор: Долгова, Наталия Валерьевна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Москва

Количество страниц: 131 с. ил.

Артикул: 2772765

Автор: Долгова, Наталия Валерьевна

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ с
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Иа,КАТРазы.
Структура Ыа,КАТРазы.
Механизм функционирования ,КАТРазы
Изоформы Ка,КАТРазы
Синтез, топогенез и дефадация Ыа,КАТРазы.
Роль Ыа,КАТРазы в функционировании различных клеток и тканей.
Роль 0, КАТРазы в поддержании ионных градиентов 0 и К ив осуществлении
связанных с этим функций
Роль Иа, КА ТРазы в структурной организации клетки и клеточной адгезии
рсубъединица Иа,КАТРазы молекула клеточной адгезии
Разделительные контакты.
Регуляция активности Ыа,КАТРазы
Белки семейства БХУЭ
Регуляция активности а, КАТРазы путем
фосфорилированиядефосфорилирования.
Регуляция активности Иа,КАТРазы посредством изменения количества молекул
фермента, расположенных в плазматической мембране.
ЭНДОГЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ Ыа,КАТРазы
Разновидности и свойства эндогенных ингибиторов Иа,КАТРазы.
Параметры, характеризующие взаимодействие эндогенных ингибиторов Ыа,К
АТРазы с ферментом
Белки крови, связывающие уабаин и уабаинподобные соединения. Перенос
сердечных гликозидов внутрь клетки и обратно
Ыа,КАТРаза РЕЦЕПТОР НОВОГО КЛАССА ГОРМОНОВ
КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ.
Роль Ыа,КАТРазы в регуляции ионных потоков. Инотропный эффект
карлиотоничсских стероидов
Токсическое действие уабаина и других кардиотоничсских стероидов
Кардиотонические стероиды как стимуляторы роста клеток. Влияние на экспрессию
белков.
Влияние кардиотонических стероидов на перестройки плазматической мембраны и
внутриклеточных везикул
Влияние кардиотонических стероидов на прикрепление клеток к субстрату и
межклеточную адгезию.
МЕЛИТТИНПОДОБНЫЕ БЕЛКИ И ИХ СВЯЗЬ С АТРазами РТИПА.
Структура и свойства мелиттина.
Взаимодействие мелиттина с клеточными белками
Мелиттинподобные белки
МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖБЕЛКОВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.
Аффинная хроматография.
Химические сшивки
Иммунопреципитация.
Лигандблотгинг протеиноверлей
Двугибридные системы.
Иммуноцитохимические методы
Метод флуоресцентного резонанса
Микрочипы
Влияние детергентов на белки.
ЦЕЛЬ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МЕТОДЫ. .
МАТЕРИАЛЫ
ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ.
Получение фракции микросом из почек свиньи.
Получение фракции микросом из солевых желез уток.
Получение препарата очищенной ,КАТРазы.
Выделение асубъединицы Ыа, КАТРазы.
Получение поликлональных сывороток против а1р1изофермента Ыа,КАТРазы, а
субъединицы Ыа,КАТРазы и мелиттина
Очистка сыворотки от альбуминов путем осаждения белков сульфатом аммония
Очистка антител на Ыа,КАТРазу методом аффинной хроматографии
Очистка антител на мелиттин методом аффинной хроматографии.
Выделение белков гомогената, взаимодействующих с антителами на мелиттин
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
Твердофазный иммуноферментный анализ I, i i
Точечный твердофазный иммуноферментный анализ I, i
i
Определение концентрации белка.
Электрофорез по методу Леммли
Окрашивание гелей Кумасси бриллиантовым голубым 0 или
Окрашивание гелей серебром.
Анализ результатов электрофореза.
Иммуноблоттинг.
Иммунопреципитация ,3i
Авторадиография
Метод протеиноверлей
Измерение активности ,3i
Измерение ингибирования ,КАТРазы мелиттином.
Оценка степени олигомеризации ,КАТРазы в присутствии мелиттина
Включение флуоресцеинизотиоцианата ФИТЦ в препараты Ыа,КАТРазы солевых
желез утки и почек кролика.
Измерение флуоресценции ФИТЦмеченных препаратов Ыа,КАТРазы из солевых
желез утки и почек кролика.
Подготовка образцов для определения концевой последовательности белков по
методу Эдмана
Подготовка образцов для массспектрометрического анализа трипсинолизных
фрагментов.
Компьютерный анализ последовательностей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение и характеристика поликлональных антител на ,3 и мелиттин Выявление белков, взаимодействующих с АТРазой, с использованием метода
иммунопреципитации.
Подбор условий для проведения иммунопреципитации.
Иммунопреципитация ,КАТРазы в комплексе со взаимодействующими с ней белками
Выявление белков, взаимодействующих с Ыа,КАТРазой, с использованием метода
протеиноверлей.
Влияние уабаина на белки, преципитирующие совместно с Ыа,КАТРазой
Выявление белков, взаимодействующих с ,КАТРазой и фосфорилируемых
эндогенными протеинкиназами.
Влияние мелиттина на ферментативную активность и олигомерное состояние Ыа,К
Исследование взаимодействия Ыа,КАТРазы с мелиттинподобными белками
Выделение мелиттинподобных белков.
Взаимодействие мелиттинподобных белков с Иа,КАТРазой.
Идентификация мелиттинподобного белка кДа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ в
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Показано, что в результате связывания уабаина с Ыа,КАТРазой происходит ее взаимодействие с Бгскиназой, сопровождающееся активацией тирозинкиназ, повышается уровень активных форм кислорода, играющих в клетке роль вторичных мессенджеров, активируется МАРкиназный каскад. Известно, что уабаин оказывает похожее влияние на гладкомышечные клетки сосудов и скелетные мышцы Х1с . Азкап А. Однако в настоящее время ясно, что в разных тканях уабаин и его аналоги могут вызывать совершенно разные эффекты. На данный момент точный механизм влияния уабаина и причина дифференцированного воздействия сердечного гликозида на клетки различного происхождения неясна. Известно, что АТРазы Ртипа, к которым относится и Ыа,КАТРаза, ингибируются пептидом из яда пчелы, мелиттином, образующим амфипатическую аспираль. Установлено, что мелиттин влияет на функционирование некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов, например активирует фосфолипазу Аг и взаимодействует с кальмодулином, препятствуя связыванию с ним эффекторных белков. Мелиттин непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей СаАТРазы саркоплазматического ретикулума и асубъединицей Н,К и Ыа,КАТРаз. Во многих тканях обнаружены белки, взаимодействующие с антителами на мелиттин, то есть имеющие в своем составе структуры, похожие на него. Представителями таких белков являются белкиактиваторы фосфолипазы Аг, относящиеся к семейству Сбслков, и мелиттинподобный белок, взаимодействующий с Н,К и СаАТРазой. Установлено, что эти белки участвуют в передаче клеточных сигналов, регуляции роста клеток и способны подавлять развитие раковых опухолей. Возможно, что мелиттинподобные белки способны взаимодействовать с Ка,КАТРазой, имеющей в своем составе участок связывания мелиттина, и принимать участие в передаче клеточных сигналов от этого фермента или в регуляции самого ионного насоса. Таким образом, выявление и идентификация белков, непосредственно взаимодействующих с Ыа,КАТРазой в различных тканях при различных условиях, является очень важной задачей, позволяющей понять механизмы регуляции активности самого фермента, а также его роли в передаче внутриклеточного сигнала. Поэтому прежде чем приступать к изучению белков, взаимодействующих с Ыа,КАТРазой, необходимо разработать методы, позволяющие работать с мембранными белками. В настоящей работе предпринята попытка использовать методы иммунопреципитации и протеиноверлей для выявления комплексов Ыа,КАТРазы со взаимодействующими белками, исследовать влияние уабаина на взаимодействия белков с этим ферментом и идентифицировать один из бел ковпартнеров Ка,КАТРазы. Ыа,Кзависимая, активируемая аденозингрифосфогидролаза, КФ 3. АТРаз Ртипа, обеспечивающих активный транспорт различных ионов 1Г , К Са2 2, 2 через мембраны прокариот и эукариот. Для транспорта ионов против электрохимического градиента все эти ферменты используют энергию АТР. Обозначение Р отражает уникальную особенность АТРаз этого типа фосфорилировать остаток аспарагиновой кислоты в процессе прохождения каталитического цикла. АТРазы этого типа имеют второе название Е1Е2 АТРазы, напоминающее о том, что в процессе каталитического цикла АТРазы постоянно переходят из i в Е2 конформацию и обратно. Каталитические субъединицы АТРаз типа имеют сходную третичную структуру и несколько практически идентичных доменов. Особенно высокую степень гомологии имеют участки последовательности, принимающие участие в связывании и гидролизе . АТРаза состоит из двух нековалентно связанных субъединиц а и р с молекулярными массами около 0 и кДа, соответственно, являющихся интегральными белками мембран рис. Каталитическая активность обеспечивается асубъединицсй АТРазы. Эта субъединица содержит в своем составе трансмембранных сегментов М 1М , содержащих аминокислотных остатков, формирующих аспирали. Канал, через который осуществляется перенос ионов натрия и калия через мембрану, образован трансмембранными доменами М4, М5, Мб и М8. Сконцевые фрагменты асубъединицы располагаются в цитоплазме. Он принимает участие в конформационных переходах и, возможно, регулирует чувствительность фермента к катионам i А.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.185, запросов: 145