Выделение и характеристика эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз из термофильных штаммов

Выделение и характеристика эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз из термофильных штаммов

Автор: Свадьбина, Ирина Владимировна

Год защиты: 2006

Место защиты: Пущино

Количество страниц: 130 с. ил.

Артикул: 2935935

Автор: Свадьбина, Ирина Владимировна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Системы рестрикциимодификации.
1.1. Классификация систем рестрикциимодификации прокариот
1.1.1. Системы рестрикциимодификации типа 1
1.1.2. Система рестрикциимодификации типа III
1.1.3. Система рестрикциимодификации типа II.
1.1.3.1. Ортодоксальный, НЕ и 1Ш подтипы
1.1.3.2. РМ системы подтипа НБ
1.1.3.3. РМ системы подтипа 1Ю
1.1.3.4. РМ системы подтипа ИТ
1.1.3.5. РМ системы подтипа НВ
1.1.3.6. РМ системы подтипа ИМ
1.2. Структура эндонуклеаз рестрикции.
1.3. Механизм гидролиза эндонуклеазами рестрикции фосфодиэфирных связей
1.4. Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу конгроля расщепления
ДНК по двум цепям.
II. ДНКметилтрансферазы систем рестрикциимодификации типа II
II. 1. Классификация ДНКметилтрансфераз
.2. Пространственная структура ДНКметилтрансфераз
.3. Биологическая роль систем рестрикциимодификации
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫIАЛ ЧАСТЬ
III. 1. Материалы.
Ш.2. Оборудование.
1.3. Методы.
III.3.1. Электрофорезу
Ш.3.2. Реакции, использованные в работе.
1.3.3. Ссквсиирование ДНК.
1.3.4. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой рестрикции
1.3.5. Приготовление электрокомпетептиых клеток.
Ш.3.6. Электротрансформация клеток Е.соИ
Ш.3.7. Щелочное выделение плазмид минипреп.
1.3.8. Очистка ДНК
1.3.9. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М миииирсп
Ш.3 Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М макснпреп
Ш.3 Выделение одиоцепочечнон формы ДНК фага на основе М.
Ш.3 Метод кислотной депуринизации.
III.3 Метод тонкослойной хроматографии нуклеиновых оснований
Ш.3 Локализация мстнлцитозина бисульфнтиым методом реакция конверсии.
Ш.3 Скрининг штаммов на наличие в них эндонуклеаз рестрикции
Ш.3 Получение и очистка лизата клеток для колоночной хромагофафии.
Ш.3 Выделение эндонуклеазы рЬК.
Ш.3 Выделение эндонуклеазы 1ЪрЪЕ1.
Ш.3 Выделение эндонуклеазы ЯугЬШ.
III.3 Выделение метилаз ЛсоК1А и ЛсоКШ
1.3 Определение активности эндонуклеаз рестрикции во фракциях
1.3 Определение функциональной чистоты эндонуклеазы
Ш.3 Метод гельхроматографнн.
III.3 Анализ фракций на наличие мстилазиой активности
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
IV. 1. Принцип детектирования эндонуклеаз рестрикции.
IV.2. Эндонуклеаза рестрикции .
IV.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции .
IV.2.2. Оптимальные условия работы фермента
IV.2.3. Определение активности эндонуклеазы рестрикции
IV.2.4. Функциональная чистота препарата фермента .
IV.2.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой
IV.2.6. Определение положения фосфодиэфириых связей, гидролизуемых на ДНК
эндонуклеазой .
IV.2.7. Влияние метилирования на расщепление узнаваемого сайта.
IV.2.8. Сравнение В.i с другими штаммами, содержащими эндонуклеазы
изошизомеры .
IV.3. Эндонуклеаза рестрикции .
IV.3.1. Выделение эндонуклеазы I.
IV.3.2. Оптимальные условия работы выделенной эндонуклеазы.
IV.3.3. Функциональная чистота препарата фермента VI
IV.3.4. Определение сайтов узнавания
IV.3.5. Определение положения фосфодиэфириых связей, гидролизуемых на ДНК
эндонуклеазой
IV.4. Эндонуклеаза рестрикции
IV.4.1. Определение зависимости содержания эндонуклеазы от фазы роста клеток
IV.4.2. Выделение эндонуклеазы .
IV.4.3. Оптимальные условия работы эндонуклеазы
IV.4.4. Функциональная чистота препарата .
1V.4.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой 4I
IV.4.6. Определение положения фосфодиэфириых связей, гидролизуемых на ДНК
эндонуклеазой .
IV.4.7. Очистка Д1I от эндонуклеазы
IV.4.8. Определение молекулярной массы
IV.4.9. Получение лестниц молекулярных длин фрагментов ДНК.
IV.5. Метилазы системы рестрикциимодификации из штамма i К
IV.5.1. Выделение ДНКметилтрансфераз
IV.5.2. Определение специфичности Д1 Iмстилтрансфераз
1V.5.3. Определение природы основания, метилируемого ., методом
тонкослойной хроматографии.
IV.5.4. Определение положения метилируемого цитозина.
IV.5.5. Получение ДНК рекомбинантного фага
IV.5.6. Определение положения в сайте ВсоК.1 метилируемого аденина.
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
Список публикаций по материазам диссертационной работы.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА.
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БадеиозилЬметионин
АТФ аденозннтрифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
БФС бромфеноловый синий
дАТФ дезоксиаденозинтрифосфат
дГТФ дсзокснгуанозинтрифосфат
дТТФ дезокситимидинтрифосфат
дЦТФ дсзоксицнтозннтрифосфат
дНТФ смесь четырех дсзоксинуклсозидтрифосфатов
ддНТФ смесь четырех дидезоксинуклсозидтрифосфатов
ДМСО диметнлсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ дитнотрентол
5шС С5метилцитозин
4 Жметилцитознн
6 Ыбметиладенин
ПААГ полиакриламидный гель
ПСА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтилен гликоль
РМ система система рестрикциимодификации
РНКаза А рибонуклеаза А
ТЕМЕД тетраэтилендиамин
i трнсгидроксиметиламинометан
ЭДГА этилендиамннтетраацетат соль
ЭР эидоиуклеазаы рестрикции
додецилсульфат натрия
I изопропилЬ1тиогала1стозид
X 5бромо4хлоро3иидолил галактозид
К2гидроксиэтилпиперазш1М2этанссриая кислота
i пииеразинэтаиссриая кислота
ВВЕДЕНИЕ


Поэтому степень рестрикции фага зависит от числа специфических последовательностей на его ДНК, хотя многие фаги выработали специфические способы преодоления системы рестрикции хозяйской клетки i , . Впервые ферменты рестрикциимодификации РМ были выделены и охарактеризованы из i i и . Эти ферменты расщепляли ДНК без образования гомогенных фрагментов. В г. Смит с соавторами из i i выделили эндонуклеазу рестрикции, которая расщепляла ДНК с образования гомогенных фрагментов. Эндонуклеазы рестрикции ЭР с такими свойствами стали основой методов генной инженерии, что привело к революции в молекулярной биологии. Последовавший после г. РМ и их разнообразие заставило ввести специальную номенклатуру i , . В названии системы входят первая буква рода бактерии, две первых буквы вида, обозначение конкретного штамма или экстрахромосомиого элемента, кодирующего РМ систему, и номер системы в порядке их обнаружения в штамме, например . Часто клетки содержат более одной системы РМ. Рекорд принадлежит штамму i i , геном которого содержит потенциальные системы РМ , . В зависимости от локализации эндоиуклеазной и метилазиой активностей на сложном белковом комплексе, на одной полипептидной цепи или на разных белках, от специфичности узнаваемая последовательность, от характера расщепления ДНК, а также кофакторов, необходимых дя проявления активностей, РМ системы разделяют на четыре типа, представленные на рис. Рис. В системах данного типа эндонуклеазная и метилтрансферазная активности локализованы на отдельных субъединицах, образующих сложный белковый комплекс с молекулярной массой кДа. Система состоит из трех типов субъединиц , и от iii в соотношении . Субъединица обеспечивает узнавание сайта, М ответственна за метилирование сайта, обеспечивает расщепление ДНК. Субъединицы и М в соотношении образуют функциональную сайтспецифическую метилазу. Мишенью метилирования метилаз всех известных систем типа I является аденин, при этом сильное предпочтение отдается полуметилированной ДИК. ДНКметилтрансфераз прокариот. Расщепление ДНК обеспечивает только комплекс 1. Для работы не только метилазы, но и эндонуклеазы необходим . Сайт, узнаваемый системами РМ типа I, состоит из двух последовательностей длиной и. Например, узнает сайт 6. Расщепление ДНК системами типа I сложный многоступенчатый процесс, сопровождаемый гидролизом АТФ. Растепление ДНК происходит на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от сайта, примерно по середине между сайтами. Такое расщепление приводит к образованию негомогенных фрагментов ДНК. Согласно первой модели, предложенной Студиср и др. ДНК с обеих сторон от сайта затягивается комплексом с образованием петель как рслаксированных, так и супсрскрученных , , , . Именно этот процесс требует гидролиза АТФ. Транслокация ДНК продолжается до тех пор, пока два комплекса, связанные разными сайтами, не столкнуться друг с другом. После этого происходит расщепление ДНК. Расщепление происходит и в том случае, если комплекс сталкивается с разветвленной структурой ДНК, но не с другими белками, связанными с ДНК. Согласно второй модели, основанной на данных силовой атомной микроскопии i , , , , комплексы, связанные с двумя разными сайтами сначала димеризуются без участия АТФ, а добавление АТФ приводит к траислокацин ДНК димером. Согласно этой модели расщепление ДНК происходит только после того, как втянутая и закрученная ДНК не может больше сокращаться. Связывание АТФ, ее гидролиз и транслокация ДНК обеспечивается субъединицей, Сконцевой домен которой содержит набор консервативных мотивов , характерных для ДНК и РНКхеликаз. Системы РМ типа 1 достаточно малочисленный класс, представленный около членами. Малочисленность объясняется, с одной стороны, тем, что к ним не применим подход, традиционно используемый для скрининга бактериальных штаммов на наличие в них систем РМ типа II, основанный на расщеплении ДНК лизатом клеток, в результате чего образуются гомогенные фрагменты, регистрируемые электрофорезом. Как отмечалось выше, при расщеплении ДНК системами типа I гомогенных фрагментов не образуется.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.195, запросов: 145