Выделение и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила : Papio hamadryas L.

Выделение и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила : Papio hamadryas L.

Автор: Цветкова, Елена Викторовна

Автор: Цветкова, Елена Викторовна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2007

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 142 с. ил.

Артикул: 3320125

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 .Современные представления о врожденном иммунитете млекопитающих
1.1.1 .Системы распознавания врожденного иммунитета млекопитающих
1.1.2. Гуморальные и клеточные эффекторы врожденного иммунитета
млекопитающих
1.2.Нейтрофильный гранулоцит в защитных реакциях организма
1.2.1 .Хемотаксис нейтроф ильных гранулоцитов
1.2.2.Адгезия нейтрофильных гранулоцитов на поверхности объектов фагоцитоза 1.2.3.Эндоцитоз, формирование фаголизосомы, инактивация и киллинг фагоцитированных микробных клеток
1.3 .Микробоцидные факторы нейтрофильных гранулоцитов
1.3.1 .Кислородзависимые факторы инактивации микроорганизмов
1.3.2.Кислороднезависимые факторы инактивации микроорганизмов
1.4.Антимикробные пептиды как молекулярные факторы врожденного иммунитета млекопитающих
1.4.1 .Классификация антимикробных пептидов 1.4.2.Общие структурные особенности антимикробных пептидов млекопитающих
и механизмы их антимикробного действия
1.4.3.Свойства антимикробных пептидов отличные от антимикробной активности
1.4.4.Гены антимикробных пептидов, их экспрессия и постгрансляционная модификация антимикробных пептидов млекопитающих
1.4.5.Экспрессия антимикробных пептидов в клетках и тканях организма млекопитающих
1.5.Антимикробные пептиды как возможные фармакологические агенты
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 .Получение лейкоцитарной массы, обогащенной нейтрофильными
гранулоцитами
2.2.Экстрагирование катионных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила
2.3.Ультрафильтрация экстрактов
2.4.Выделение и очистка адефенсинов из экстракта лейкоцитов человека
2.4.Выделение и очистка адефенсинов из экстракта лейкоцитов кролика
2.5.Выделение и очистка тетадефенсина ЮТ1 из экстракта лейкоцитов
макаки резус
2.6.Методы электрофоретического разделения и анализа пептидов
2.6.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе
2.6.2.Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
2.6.3.Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе
2.7.0бращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
2.8.Методы определения молекулярной массы пептидов
2.8.1.Определение молекулярной массы методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
2.8.2.0пределение молекулярной массы методом массспектрометрии МА1Л1ТОЕ 2.9.Определение аминокислотного состава пептидов
2Определение аминокислотной последовательности в молекулах пептидов
2Определение наличия дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью окисления надмуравьиной кислотой
пределение количества дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью их восстановления и последующего алкилирования
2Методы определения концентраций пептидов
2Методы определения антимикробной активности пептидов
.Микроорганизмы
.0пределсние антимикробной активности методом наложения гелей
.Определение антимикробной активности методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле
.0пределение минимальных ингибирующих концентраций пептидов
.0пределение микробоцидного действия полученных пептидов
2Определение влияния пептидов на проницаемосгь наружной и цитоплазматической мембран Е.соИ МЬр
2Определение гемолитической активности пептидов
2Статистическая обработка результатов
3.РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1.Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами
3.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила
3.3.Определение молекулярных масс выделенных пептидов методом массспектрометрии МАЬТ0Р
3.4.0пределение наличия и количества дисульфидных связей в молекулах выделенных пептидов
3.5.Определение аминокислотного состава выделенных пептидов
З.б.Определение первичной структуры выделенных пептидов
3.7.Выделение и очистка циклического 0дефенсина ЮТЫ из экстракта лейкоцитов макаки резус
3.8.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов
3.8.1.Определение минимальных ингибирующих концентраций выделенных пептидов
3.8.2.Микробоцидное действие выделенных пептидов
3.8.3.Изучение влияния различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов
3.8.Изучение влияния выделенных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е.соИ МЬ р
3.9.Изучение гемолитической активности выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека
4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1.Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами
4.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила 2 4.3.Определение первичных структур выделенных пептидов павиана гамадрила
4.4.Выделсние и очистка циклического 0дефенсина ЛТЕМ из лейкоцитов макаки резус
4.5.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов
4.5.1.Определение минимальных ингибирующих концентраций и микробоцидной активности выделенных пептидов
4.5.2.Влияние различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов
4.5.2.1.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов в зависимости
от содержания С1 в среде
4.5.2.2.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов в зависимости от среды
4.5.2.3.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов при добавлении в среду сыворотки крови
4.6.Влияние выделенных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е.соН МЬ р
4.7.Гемолитическая активность выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека
5.ВЫВОДЫ
6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМП антимикробные пептиды
ИЛ1 интерлейкин
ИЛ6 интерлейкин
ИЛ интерлейкин
ИЛ интерлейкин
КОЕ колониеобразующая единица
ЛПС липополисахарид
ЛФ лактоферрин
МАК мембраноатакующий комплекс
МИК минимальная ингибирующая концентрация
МКА молекула клеточной адгезии
МПО миелопероксидаза
МРМ маннозный рецептор макрофагов
МСЛ маннансвязывающий лектин
НГ нейтрофильный гранулоцит
ОНФГ онитрофенилрОгалактопиранозид
ОФ ВЭЖХ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ полиакриламидный гель
ПАМП патогенассоциированные молекулярные паттерны
ПРР паттернраспознающие рецепторы
ТАП трахеальный антимикробный пептид
ТГС триптический гидролизат сои
ТПР толлподобные рецепторы
СРВ Среактивный белок
САП сывороточный амилоид Р
ФНОа фактор некроза опухолей а
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭК эффективная концентрация
ЯМР ядерномагнитный резонанс
рецептор комплемента
5 адефенсин человека 5 i
6 адефенсин человека 6 i
I1,2 i i 1,
1 адефенсин человека 1 i i
I3 i i 3 кВ ядерный фактор кВ 1 адефенсин кролика 1 i
2 адефенсин кролика 2 i
1 протегрин 1 i
II адефенсины павиана гамадрила i i адефенсины макаки резус i
0дефенсины макаки резус i
адефенсины макаки резус i
ВВЕДЕНИЕ


Широкий спектр антимикробной активности, которая сохраняется и при повышенном содержании в среде , низкая цитотоксичность в отношении клеток макроорганизма, небольшой размер молекул и легкость синтеза делает 0дефенсины привлекательными объектами в этом смысле. Специальный интерес представляют антивирусные свойства 0дефенсинов. Обладая способностью связывать гликопротеины вирусных оболочек 0дефенсины i vi предотвращают заражение клеток вирусами гриппа, герпеса, иммунодефицита человека. В настоящий момент активно и всесторонне изучаются антивирусные свойства ретроциклинов, химически синтезированных на основе знания структуры псевдогенов 0дефенсинов человека, у которого трансляция этих пептидов невозможна изза наличия стопкодона, локализованного в той части мРНК, которая кодирует сигнальную последовательность молекулыпредшественницы . Поскольку на уровне пептидного продукта 0дефенсины были найдены пока только у макаки резус, представляет интерес поиск других представителей этого нового и недостаточно изученного подсемейства дефенсинов у родственных видов обезьян. Эти данные могут быть полезны для понимания закономерностей возникновения и формирования разнообразия АМН дефенсинового семейства у приматов, в том числе и у человека. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы были поиск и изучение физикохимических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила. Изучить изменение проницаемости внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии . Изучить гемолитическую активность выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека. В результате проведенного исследования из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделены три новых антимикробных пептида, относящихся к подсемейству адефенсинов и названных i i. Получены приоритетные данные об антимикробной активности в отношении грамположительных бактерий ii и , грамотрицательной бактерии ii i и низшего гриба i i, сопоставимое с антимикробной активностью адефенсина человека 1. Наряду с этим, выделены два новых антимикробных пептида, которые по ряду признаков молекулярная масса, аминокислотный состав, характер антимикробной активности принадлежат к недавно открытому подсемейству 0дефенсинов. Впервые показано, что адефенсины и 0дефенсин 1 макаки резус взаимодействуют с цитоплазматической мембраной грамотрицательной бактерии К i различным образом. Получены данные о гемолитической активности выделенных пептидов. Предложен метод получения 9дефенсина 1 макаки резус и 0дефенсиноподобных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила. Основные положения, выносимые на защиту 1 . Из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделено и охарактеризовано по физикохимическим свойствам шесть катионных антимикробных пептидов. На основании результатов определения первичной структуры доказана принадлежность трех пептидов к семейству адефенсинов. Структурнофункциональный анализ двух пептидов позволяет отнести их к семейству 0дефенсинов. Дефенсины и 0дефенсиноподобные Пептиды и павиана гамадрила
являются эффективными антимикробными агентами с широким спектром микробоцидного действия. Антимикробная активность адефенсинов и 0дефенсиноподобных Пептидов и павиана гамадрила различается в присутствии повышенных концентраций
4. Антимикробная активность адефенсина 3 и 0дефенсиноподобного Пептида павиана гамадрила не изменяется в широком диапазоне , но ингибируется при добавлении в среду сыворотки крови. Дефенсины и 0дефенсины взаимодействуют с цитоплазматической мембраной . Дефенсин 3 и 0дефенсиноподобные Пептиды и павиана гамадрила не вызывают гемолиза эритроцитов человека при концентрациях, на порядок превышающих минимальные ингибирующие концентрации. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 2 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 7 источников, из них 7 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована рисунками и 7 таблицами. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ в отечественных журналах и сборниках по материалам трудов СПбГУ и научных конференций. Совета НИИ физиологии им. Ухтомского в гг. Россия, Екатеринбург, .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.271, запросов: 145