Внеклеточные протеолитические ферменты Streptomyces Spheroides ШТ.35

Внеклеточные протеолитические ферменты Streptomyces Spheroides ШТ.35

Автор: Крейер, Валериана Георгиевна

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 1985

Место защиты: Москва

Количество страниц: 210 c. ил

Артикул: 3429712

Автор: Крейер, Валериана Георгиевна

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современная классификация протеолитических
ферментов.
1.2. Области применения протеолитических ферментов микробного происхождения.
1.3. Методы выделения протеолитических ферментов.
1.4. Характеристика внеклеточных протеолитических ферментов стрептомицетов на примере цротеиназ проназы препарата из культуральной жидкости i КI
1.4.1. Общая характеристика проназы.
1.4.2. Трипсиноподобный фермент проназы
1.4.3. Химэтрипсинаподобные ферменты проназы .
1.4.4. Субтилизиноподобные ферменты проназы
1.4.5. Амию пептидазы проназы
1.4.6. Карбоксипептидаза проназы .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Список сокращений, использованных в работе
2.2. Выращивание продуцента
2.3. Сорбенты, использованные для выделения и очистки протеолитических ферментов
2.3.1. Ионообменные материалы.
2.3.2. Аффинные сорбенты .
2.3.3. Сорбенты для гельхроматографии.
2.4. Субстраты для определения протеолитической
активности.
2.5. Ингибиторы протеиназ .
2.6. Методы определения концентрации белка.
2.7. Методы определения протеолитической активности
2.7.1. Определение неспецифической протеолитической
активности по денатурированным растворимым белкам
2.7.2. Определение активности по нерастворимым белковым субстратам.
2.7.3. Метод определения фибринолоззической активности в тонком слое .
2.7.4. Метод определения тромболитической активности .
2.7.5. Определение литической активности .
2.7.6. Определение эстеразной активности протеиназ
2.7.7. Определение аадцазной активности
2.7.8. Определение карбоксипептвдазной активности.
2.7.9. Изучение субстратной специфичности карбоксипептццазы
2.8. Методы ввделения комплексного препарата протеолити
ческих ферментов .i шт. и отдельных
его компонентов
2.8.1. Выделение комплексного препарата из культуральной жидкости .i ШТ. .
осаждением сульфатом амшния, ионообменной хроматографией на ДЕАЕцеллюлозе, гельхроматографией на сефадексе .
2.8.2. Получение комплексного препарата протеиназ методом аффинной хроматографии
2.8.3. Выделение субтилизиноподобной протеиназы .i шт.
2.8.4. Выделение химотрипсиноподобной протеиназн
.i ШТ
2.8.5. Выделение лейцинаминопептидазы и второго химотрипсиноподобного фермента i . i шт. .
2.8.6. Выделение карбоксипептидазы .i
2.9. Методы биохимического и физикохимического исследования гомогенных ферментов
2.9.1. Определение рНоптимума активности
2.9.2. Определение температурного оптимума активности
2.9.3. Изучение рйустойчивости ферментов
2.9.4. Изучение термостабильности ферментов
2.9.5. Дискэлектрофорез белков в полиакриламидном
2.9.6. Изоэлектрофокусирование
2.9.7. Определение молекулярной массы ферментов
2.9.8. Определение аминокислотного состава.
2.9.9. Определение концевой аминокислотной
последовательности
2 Метод изучения тромболитической активности препарата протеиназ .i шт. i viv
2 Исследование фибринолитической системы крови при внутривенном введении препарата протеиназ . i шт. .
П. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕШЕНТОВ .i ШТ.
3.1. Изучение динамики накопления протеинзз в процессе роста культуры .ВО
3.2. Выделение и некоторые свойства комплекса протеиназ .i. шт., полученного методом осаждения сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕАЕцеллюлозе, гельхроматографии на сефадексе
3.3. Изучение биологической активности препарата протеиназ .i ШТ. .
3.3.1. Изучение тромболизиса у крыс при внутривенном введении препарата .
3.3.2. Изучение биохимических показателей крови крыс при внутривенном введении препарата протеиназ .i ШТ.
3.3.3. Исследование токсичности ферментного препарата протеиназ .i ШТ. .
3.4. Выделение комплексного препарата протеолитических ферментов методом аффинной хроматографии и исследование его некоторых свойств
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУБШИШНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ .i шт.
4.1. Выделение и очистка
4.2. Изучение физикохимических СВОЙСТВ .
4.3. Влияние ингибиторов на активность .Д
4.4. Поведение в 6М гуанидингидрохлориде .
4.5. Субстратная специфичность I
4.6. Аминокислотный состав .
ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ВНЕКЛЕГОЧШХ ХИМОТШПСИНОЛОДОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ и I.
5.1. Выделение и очистка и I.
5.2. Изучение фИЗИКОХИМИЧвСКИХ свойств Д
5.3. Влияние ингибиторов на активность .
5.4. Поведение в 6М гуанидингидрохлориде .
5.5. Субстратная специфичность .
5.6. Аминокислотный состав .
ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ
СВОЙСТВ ЛЕЙЦИНАМИЮПЕШИДАЗЫ .i шт.
6.1. Выделение и очистка лейцинаминопептидазы
6.2. Исследование некоторых энзиматических и физикохимических свойств лейцинаминопептидазы .
ГЛАВА 7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КАРБОКШПЕШИДАЗЫ .i шт.
7.1. Выделение и очистка карбоксипептидазн .
7.2. Изучение некоторых физикохиглических свойств карбоксипептидазн.
7.3. Влияние ингибиторов на активность карбоксипептидазн
7.4. Субстратная специфичность карбоксипептидазн
7.5. Аминокислотный состав карбоксипептидазн
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Сульфат аммония, как правило, не оказывает денатурирующего воздействия на ферменты, а в некоторых случаях стабилизирует их. Существенное влияние на эффективность фракционирования протеиназ оказывают раствора и температура, т. Диксон,Уэбб, . Для фракционного осаждения ферментов используют также оргатнические растворители этиловый, изопропиловый спирты, ацетон, диоксан, изменяющие степень гидратации белковых макромэлекул Авилова, Егоров, . Примером использования метода высаливания является получение препарата протеолитических ферментов римзпротелина из культуральной жидкости ЗЬг. Шишкова и др. Препарат обнаруживал при электрофорезе на бумаге 5 компонентов с протеолитической активностью. Для выделения протеолитического комплекса зЬг. Цыперович и др. Полученные препараты были пригодны для различного технического использования, а также для дальнейшей более тонкой очистки отдельных компонентов протеолитического комплекса. Наиболее распространенным приемам тонкого разделения белковых смесей является ионообменная хроматография. В начале пятидесятых годов Мур и Штейн с соавторами впервые использовали син
тетические катиониты для хроматографии белков ,i, i . Однако, использованный в их работах катионит Амберлит I имел очень малую скорость протекания растворов через колонку не выше ,5 млчсм. Длительность таких препаративных процессов была даже больше, чем при препаративной гельхроматографии на сефадексах и биогелях. Поэтоьу в последующих работах исследователи наиболее часто использовали ионообменные целлюлозы, позволяющие применять более интенсивные процессы разделения Николаев, . Однако, при этом белки с близкими изоэлектрическими точками не всегда хорошо разделяются, как например, при очистке химэтрипсиногена , ii,3 что требует дополнительной рехроматографии компонентов. Высокую специфичность сорбции протеолитического комплекса из культуральной жидкости . КБ2, Его большая емкость и селективность сорбции позволяют сконцентрировать протеиназы на колонке при 6,2. Последующее повышение элюирующего буфера до 9,2 приводит к полной десорбции протеолитического комплекса, активность которого во много раз выше исходной культуральной жидкости Богданов и др. Многие исследователи в нашей стране и за рубежом использовали для выделения протеолитических комплексов ИЗ . I, из . Петрова, Зуева, Лагутина, i, i, а,Ъ,с. Для фракционирования обычно применяли изменение ионной силы элюирующего раствора положительный эффект оказывало увеличение длины колошей. Однако, нужно отметить, что использование ионообменных сефадексов и целлюлоз требует предварительного обессо
ливания исходных белковых растворов. С середины х годов интенсивно развивается внедрение специально синтезированных гидрофильных пористых карбоксильных маттериалов типа Сферой в биохимическую практику высокоочиценных ферментных препаратов i, , . Препаративное получение протеолитических, в том числе фибринолитических препаратов в нашей стране основано на использовании как специально синтезируемых катионитов типа Биокарб, так и технических макропористых карбоксильных катионитов, получаемых гидролизом сополимеров полиакрилонитрила Шатаева и др. Шатаева, Самсонов, Радзявичус и др. Разработка препаративных ионообменных методов выделения протеолитических ферментов из культуральной жидкости микроорганизшв требует знания основных физикохимических факторов, ответственных за селективное и обратимее связывание белковых макроюлекул с этими ионообменными материалами. Сравнение сорбционных свойств ионообменных материалов и их нейтральных аналогов, не содержащих ионогенных групп, показало, что сорбция белковых цвиттерионов на ионообменной поверхности проходит по двум механизмам одновременно по механизму обратимей и необратимей сорбции. Оба механизма дают изотерцу сорбции Лэнгмюра, но обраттимая сорбция очень чувствительна к значению раствора и увеличивается с увеличением ионообменной емкости мембран Бреслер и др. Необратимая сорбция, напротив, мало чувствительна к значению раствора и коррелирует с гидрофобностью поверхности чем выше гидрофобность поверхности, тем больше необратимая сорбция белка ii, i , .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.230, запросов: 145