Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека

Влияние гликозилирования на процессинг предшественника натрийуретического пептида B-типа человека

Автор: Семенов, Александр Геннадьевич

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 130 с. ил.

Артикул: 4418626

Автор: Семенов, Александр Геннадьевич

Стоимость: 250 руб.

Оглавление.
Список сокращений
Введение.
2. Обзор литературы
2.1. Семейство натрийуретнческих пептидов.
2.1.1. Открытие натрийуретнческих пептидов
2.1.2. Натрийуретический пептид Втипа представитель семейства натрийуретнческих пептидов.
2.2. Синтез и секреция
2.2.1. Структура гена .
2.2.2. Экспрессия в различных тканях
2.2.3. Регуляция секреции и экспрессии
2.3. Процессинг молекулнредшественников
2.3.1. Семейство конвертаз прогормонов
2.3.2. Экспрессия и процессинг молскулпредшсствинников .
2.3.3. Фурин и корин потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекулнредшественников .
2.4. Посттрансляционныс модификации и
2.4.1. Представления о существовании олигомерных форм и
2.4.2. и как Оглнкопротенны.
2.4.3. Огликозилирование наиболее распространенный тип посттрансляционных модификаций белков.
2.5. Рецепторы натрийуретнческих пептидов.
2.5.1. Семейство рецепторов натрийуретнческих пептидов
2.5.2. Активация и десснситизация рецепторов
2.6. Метаболизм в кровотоке.
2.7. Физиологическое действие .
2.7.1. Действие на почки
2.7.2. Действие на сердечнососудистую систему
2.7.3. Действие на эндокринную систему
2.8. диагностический и прогностический биохимический маркер состояния сердечной недостаточности.
2.8.1. Сердечная недостаточность. Общая характеристика
2.8.2. Патофизиология СН
2.8.3. Терапевтическое применение иатрийуретических пептидов
2.8.4. Диагностика СН.
2.8.5. Измерение концентрации и в крови.
2.9. Процессинг молекулпредшсствсшшков возможный регуляторный механизм содержания активной формы в крови
2.9.1. Формы в крови
2.9.2. превалирующая форма в крови больных с СМ
2.9.3. Эндокринный парадокс.
3. Материалы и методы.
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярнобиологических исследований.
3.1.2. Реактивы и материалы для клеточнобиологических исследований
3.2. Методы исследования
3.2.1. Иммунохимичсскис и биохимические методы
3.2.1.1. Прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвичтипа. Общие принципы .
3.2.1.2. Коныогирование антител.
а Коныогирование антител с пероксидазой хрена
б Коныогирование антител со стабильным хелатом европия.
в Коныогирование антител с производным биотина.
3.2.1.3. Прямой пимуноферментный анализ.
3.2.1.4. Прямой иммунофосфоресцентный анализ
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвичтипа
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвичтипа с направленной сорбцией антител на планшете.
3.2.1.6. Иммобилизация антител на активированной сефарозе
3.2.1.7. Электрофорез в ПЛАГв присутствии ДСИ в тристрициновой буферной системе.
3.2.1.8. Вестернбдоттинг.
3.2.1.9. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.
а Визуализация белковых полос с помощью хромогенного субстрата диаминобензидина
б Визуализация белковых полос с использованием метода усиленной хемилюминссценции ii,
3.2.1 Экстракция и иммунопреципитация с использованием аффинного носителя
а Экстракция из объединенной плазмы больных СН
б Экстракция рекомбинантного из объединенной кондиционированной среды.
в Микроэкстракция методом аффинной хроматографии
г Иммунопреципитация
3.2.1 Хроматографическое разделение белков
а Ионообменная хроматография.
б Гельфильтрация
в Обратнофазовая хроматография
3.2.1 Ферментативное дегликозилирование ВИР.
3.2.1 Химическое дегликозилирование рекомбинантного , экспрессированного в клетках НЕК 3
3.2.1 Расщетение рекомбинантным фурином i vi.
а Расщепление рекомбинантного .
б Расщепление эндогенного .
3.2.1 Массспектрометричсский анализ
3.2.2. Молекулярнобиологические методы.
3.2.2.1. Получение молекулярногенетической конструкции V для экспрессии рекомбинантного в клетках мчекопитающих.
3.2.2.2. Получение молекулярногенетических конструкций для экспрессии мутантных форм .
3.2.3. Клеточнобиологические методы
3.2.3.1. Культивирование клеточных линий НЕК 3, СНОК1, I 3.
3.2.3.2. Транзшпорная трансфекция эукариотических клеточных линий.
4. Результаты исследования и их обсуждение
4.1. Сравнение профилей иммунорсактивносги эндогенных и .
4.2. Создание молекулярногенетической конструкции для экспрессии рекомбинантного в линиях клеток млекопитающих.
4.3. Экснресиия в клеточной линии НЕК
4.3.1. Оценка уровня экспрессии
4.3.2. Определение оптимального времени культивирования клеток НЕК 3 после
проведения трансфекции
4.3.3. Анализ форм в кондиционированной среде клеток линии НЕК 3, трансфицированных конструкцией V
4.4. Степень гликозилировання участка и уровень процессинга
4.4.1. Иммунореактивность и , экспрессированных в клеточных линиях СНОК1 и I ЗТЗ.
4.4.2. Уровень процессинга при экспрессии в клеточных линиях НЕК 3, СНОК1 и III ЗТЗ.
4.5. Получение очищенного препарата , экспрессированного в клеточной линии НЕК 3.
4.5.1. Выделение и очистка НЕК 3.
4.5.2. Характеризация очищенного препарата НЕК 3.
4.6. Влияние гликозилировання участка, расположенного вблизи сайта процессинга, на расщепление конвертазой нрогормонов фурнном
4.6.1. Расщепление , экспрессированного в клетках НЕК 3, рекомбинантным фурином
4.6.2. Расщепление эндогенного рекомбинантным фурином.
4.7. Процессинг мутантных форм НЕК
4.7.1. Сканирующий аланиновый мутагенез
4.7.2. Оценка уровня процессинга мутантных форм .
4.7.3. Исследование процессинга дикого типа и формы ТА с использованием метода гельфильтрации
4.7.4. Исследование , образующегося при процессинге мутантной формы гес ТА, с использованием метода массспектрометрии
4.8. Анализ филогенетической консервативности феномена ингибирования процессинга под действием гликозилировання
Заключение.
Выводы.
Благодарности
Список цитируемой литературы


Однако даже предположить, на каком этапе происходит нарушение, достаточно сложно, так как молекулярные механизмы процессинга в настоящее время практически не изучены. В данной работе в качестве возможного механизма регуляции процессинга рассматривается гликозилирование аминокислотных остатков, расположенных рядом с сайтом процессинга. Предположение о возможном влиянии гликозилирования на процессинг было высказано в нашей лаборатории на основании данных, полученных в недавних исследованиях. Было показано, что и , циркулирующие в крови больных с СН, являются Огликопротеинами. Для рекомбинантного , экспрессированного в линии клеток млекопитающих СНО клетки яичника китайского хомяка, и соавторы идстифицировали 7 сайтов гликозилирования Т, , , Т, , Т и Т . В нашей лаборатории было показано, что центральный участок а. Таким образом, целью данной работы было исследование возможного механизма регуляции процессинга , основанного на гликозилировании фрагмента молекулы, расположенного рядом с сайтом процессинга. Исследование влияния гликозилирования на процессинг было проведено на эндогенном , циркулирующем в крови больных с СН, и рекомбинантном , экспрессированном в линиях клеток млекопитающих, с использованием широкою набора иммунохимичсских, биохимических и молекулярнобиологических методов. Провести сравнительное исследование профилей гликозилирования и , циркулирующих в крови больных с СН. Разработать метод экспрессии рекомбинантного в линиях клеток млекопитающих. Выбрать модельную систему для исследования влияния гликозилирования на процессинг . Разработать метод получения и очистки препарата рекомбинантного , экспрессированного в линии клеток млекопитающих. Охарактеризовать иммунохимические и биохимические свойства очищенного препарата рекомбинантного . Исследовать влияние гликозилирования на процессинг рекомбинантного и эндогенного i vi под действием конвертазы прогормонов фурин. Исследовать сайтспецифичность процессинга под действием фурина. Создать молекулярногенетические конструкции для экспрессии мутантных форм ргоВЫР, содержащих замены остатков серина и треонина, расположенных в непосредственной близости от сайта процессинга, на остатки аланина. Провести исследования эффективности процессинга полученных мутантных форм ргоВЫР. В начале XVII века Уильям Гарвей впервые подробно исследовал процессы циркуляции крови и указал на центральную роль сердца как динамического насоса, обеспечивающего циркуляцию крови по сосудам. Результаты своих исследований Гарвей подробно изложил в работе Анатомическое исследование о движении сердца и крови у животных, где впервые сформулировал теорию кровообращения по замкнутой системе сосудов и привел экспериментальные доказательства в ее пользу. Экспериментальные данные, полученные Гарвеем, стали основой новой концепции, которая сменила известные со времен Аристотеля и Галена представления о существовании двух отдельных типов крови, венозной и артериальной, выполняющих разные функции и циркулирующих по не связанным друг с другом сосудам. Представления о сердце как об органе, выполняющем лишь функцию динамического насоса, просуществовали более 0 лет. Лишь в х годах XX века было высказано предположение, что сердце, помимо функции насоса, обеспечивающего перемещение крови по сосудам, может также иметь дополнительные функции, связанные с регуляцией натрийуритической и диуретической функции почек. Впервые в исследовании, проведенном II и в г. Таким образом, этой группой исследователей была обнаружена связь механорецепторов миокарда с натрийуретической и диуретической функцией почек . В этом же году исследования методом электронной микроскопии срезов сердца морской свинки, выполеннные i и соавторами, позволили выявить морфологические различия кардиомиоцитов предсердия и желудочков i . В результате, i и соавторами было показано, что кардиомиоциты предсердий содержат гранулы, похожие по структуре на запасные гранулы, обнаруживаемые в клетках эндокринных органов, активно продуцирующих гормоны. Однако функции 1ранул и природа запасаемого в них вещества оставались неизвестными. Немного позднее . В .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.224, запросов: 145