Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов

Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов

Автор: Беклемишев, Анатолий Борисович

Шифр специальности: 03.00.04

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2004

Место защиты: Новосибирск

Количество страниц: 413 с. ил.

Артикул: 2753533

Автор: Беклемишев, Анатолий Борисович

Стоимость: 250 руб.

1.1. Основные направления иммунопрофилактики инфекций.
1.2. Формирование новых направлений в иммунопрофилактике и диагностике инфекций в х х годах
1.3. Современные направления в области вакцинологии
1.4. Молекулярные методы в диагностике инфекций
1.5. Структурные белки вируса осповакцины, локализация кодирующих их генов в вирусном геноме
1.5.1. Структурные белки вируса осповакцины.
1.5.2. Картирование генов в геноме вируса осповакцины.
1.6. Общая характеристика стафилококковых токсинов
1.7. Структура и биологические свойства стафилококкового энтеротоксина типа А СЭА.
1.8. Использование моноклональных антител в изучении функционально значимых участков стафилококковых токсинов и создании диагностических тестсистем.
1.9. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса.
1 Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза
1 Современные способы обнаружения микобактерий. Недостатки и преимущества.
1 Эпидемиология клещевого боррелиоза
1 Патогенез и клиника клещевого боррелиоза
1 Молекулярнобиологические характеристики спирохет В. i
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы, приборы, оборудование
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Приборы и оборудование
2.1.3. Ферменты
2.1.4. Использованные в работе штаммы микроорганизмов
2.1.5. Векторные ДНК и рекомбинантные плазмиды, содержащие клонированные фрагменты ДНК
2.1.6. Животные
2.1.7. Клеточные линии
2.1.8. Сыворотки и антигены
2.1.9. Питательные и конденционированные среды
2.1 Буферные среды и системы
2.2. Молекулярнобиологические методы исследования
2.2.1. Методы работы с РНК
2.2.2. Методы выделения препаратов ДНК
2.2.3. Анализ и очистка ДНК методами гельэлектрофореза
2.2.4. Амплификация ДНК и РНК в системе ПЦР или ОТПЦР
2.2.5. Секвенирование ДНК
2.2.6. Филогенетический анализ геномных последовательностей
2.3. Иммунохимические методы исследовании
2.3.1. Иммунизация животных
2.3.2. Определение концентрации иммуноглобулинов
2.3.3. Получение 1дО и 1дМ
2.3.4. Получение Бсфрагментов 1дО кролика
2.3.5. Приготовление СПА сорбента
2.3.6. Иммуноферментный анализ
2.3.7. Радиоиммунный анализ РИА
2.3.8. Иммунохимический анализ продуктов бесклеточной трансляции
2.3.9. Иммуноблоттинг
2.4. Методы гибридомной технологии
2.4.1. Приготовление иммуногенных форм токсичных антигенов
2.4.2. Иммунизация мышей для получения гибридом
2.4.3. Гибридизация клеток и клонирование гибридом
2.4.4. Культивирование гибридом
2.4.5. Криоконсервация и размораживание клеток
2.4.6. Выделение моноклональных антител МКА
2.4.7. Мечение МКА
2.4.8. Определение изотипов тяжелых цепей МКА
2.4.9. Определение константы связывания МКА с антигеном
2.5. Генноинженерные методы
2.5.1. Методы работы с бактериями
2.5.2. Ферментативная обработка препаратов ДНК
2.5.3. Введение радиоактивной метки в ДНК
2.5.4. Клонирование ДНК в составе бактериальных векторов
2.5.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соН
2.6. Методы работы с белками ПО
2.6.1. Выделение рекомбинантных белков ПО
2.6.2. Определение концентрации растворимого белка
2.6.3. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ
2.7. Специальные методы анализа
2.7.1. Инфицирование культур клеток вирусами
2.7.2. Культивирование и очистка вируса осповакцины и эктромелии
2.7.3. Культивирование и очистка вируса гриппа
2.7.4. Культивирование МАиЬегсШоэ на твердой питательной среде
2.7.5. Фракционирование вирионных белков ВОВ и ВЭМ
2.7.6. Препаративный электрофорез белков ВОВ
2.7.7. Дегликозилирование белков

2.7.8. Выделение моноцитов из крови человека и индукция синтеза интерлейкина 1
2.7.9. Биологическое тестирование интерлейкина 1
2.7 Контроль пролиферации спленоцитов
2.7 Приготовление комплекса СЭА
2.7 Обработка I лизоцимом
2.7 Обработка I КонА
2.7 Сбор клещей Ix
2.7 Культивирование спирохет .i
2.7 Генотипирование спирохет .i
2.7 Оценка иммуногенности препаратов индивидуальных белков ВОВ и их комплексов
2.7 Испытания прототипов вакцины на животных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание молекулярнобиологической базы для исследований структурнофункциональной организации патогенных вирусов.
3.1.1. Метод бесклеточных белоксинтезирующих систем.
3.1.2. Метод синтеза кДНК в системе обратной транскрипции.
3.1.3. Выделение и анализ индивидуальных мРНК из клеток эукариот.
3.2. Исследование структурнофункциональной организации геномов вирусов гриппа и разработка прототипа противогриппозной молекулярной вакцины.
.1. Получение образца субъединичной комбинированной противогриппозной вакцины. Анализ иммуногенной активности препарата.
.2. Анализ первичной структуры гена гемагглютинина штамма ААлмаАта.
3.3. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины и картирование генов белков р
3.3.1. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины
3.3.2. Картирование гена белка р сердцевины ВОВ
3.3.3 Выделение специфической мРНК, кодирующей белок р оболочки ВОВ и картирование гена белка р
3.4. Конструирование прототипа молекулярной противооспенной вакцины
3.4.1 Характеристика антигенных и протективных свойств комплексов белков вируса осповакцины.
3.4.2. Характеристика безвредности и реактогенности препаратов вакцины против оспы.
3.5. Изучение иммунологических свойств стафилококкового энтеротоксина А СЭА
3.6. Получение и анализ моноклональных антител МКА к стафилококковому энтеротоксину А СЭА. Конструирование иммуноферментной тестсистемы на основе МКА.
3.7. Получение моноклональных антител к стафилококковому альфатоксину методом иммунизации i vi.
3.7.1 Свойства моноклональных антител к
3.7.2. Разработка иммуноферментного метода определения в крови больных с септическим процессом.
3.8. Разработка метода обнаружения вирусов гепатита В и С в биосубстратах методом ПЦР
3.8.1. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа
3.8.2. Испытание разработанного метода детекции вирусов гепатита В и С на клинических образцах
3.9. Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК .ii и .vi
Щ
3.9.1. Разработка метода дифференциальной детекции микобактерий туберкулзного комплекса на основе двухраундовой ПЦР.
3.9.2. Разработка способа дифференциального выявления ДНК М.i и .vi на основе многоцикловой однораундовой ПЦР.
3.9.3. Испытание разработанного способа выявления ДНК на клинических образцах, содержащих лекарственноустойчивых возбудителей туберкулза
3 Разработка иммуноферментного способа диагностики иксодового клещевого боррелиоза, основанного на рекомбинантных антигенах
. Определение зараженности клещей, собранных на территории Сибири
. Конструирование рекомбинантных штаммов .i, продуцирующих антигены и фрагмент новосибирского изолята .iii
. Разработка прототипов иммуноферментных тестсистем для диагностики начальных стадий Лаймборрелиоза
. Оптимизация наработки и выделения рекомбинантных антигенов из штаммовпродуцентов .i
3 Получение рекомбинантных штаммов .i, продуцирующих стафилококковый атоксин
. Анализ экспрессии структурной области генов атоксина в клетках .i
. Конструирование серии векторов для экспрессии в клетках .i
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЯ
Список сокращений В настоящей работе использованы символы и сокращения соединений и процессов, структурных компонентов и их производных, соответствующие рекомендациям Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии и Международного союза биохимиков, а также следующие основные аббревиатуры и акронимы
ВСР 5бром4хлор3индолилфосфат
аитр дезоксирибонуклеозид5трифосфат
вАЯ пероксидазный конъюгат коза анти кролик
МВТ нитротетразолиум голубой
МТР рибонуклеозидтрифосфат
ЯАМ пероксидазный конъюгат кролик анти мышь
тся Т клеточный рецептор
тббт токсин синдрома токсического шока
а.о. аминокислотный остаток
АгИФА иммуноферментный анализ на антиген
АО К антителообразующая клетка
БОЕ бляшкообразующая единица
ВОВ вирус осповакцины
ВОК вирус оспы кроликов
ВЭМ вирус эктромелии
ГАТ гипоксантин, аминоптерин, тимидин среда
Да дальтон
ДСН додецилсульфат натрия
дцДНК двуцепочечная форма ДНК
е.а. единицы активности
ИАЖ иммуноасцитная жидкость
ИКБ иксодовый клещевой боррелиоз
ИЛ интерлейкин
кДа килодальтон
КонА конканавалин А
КРС крупный рогатый скот
кондиционированная среда смешанной культуры
лимфоцитов
КСТ кондиционированная среда тимоцитов
ЛПС липополисахарид
ЛСН лауроилсаркозилат натрия
ЛФ лимфоцит
МДП мурамилдипептид
МКА моноклональные антитела
МНС главный комплекс гистосовместимости
ОРС открытая рамка считывания
п.о. пара оснований
ПААГ полиакриламидный гель
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ИКС полная культуральная среда
РКЭ развивающийся куриный эмбрион
реакция нейтрализации
РИГА реакция непрямой гемагглютинации
РНИФ реакция непрямой иммунофлюоресценции
РСК реакция связывания комплемента
РТГА реакция торможения гемагглютинации
стафилококковый атоксин
СКЛ смешанная культура лимфоцитов
СПА стафилококковый протеин А
СЭ А, В, С, стафилококковые знтеротоксины А, В, С, , Е,
, Е,
ФГА фитогемагглютинин
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФСБ фосфатносолевой буфер
ФСБТБ фосфатносолевой буфер с детергентом и бычьим
сывороточным альбумином ФСБТЖ ФСБ с детергентом и желатиной
ХАО хорионаллантоисная оболочка
ВВЕДЕНИЕ


На сегодняшний день получены экспериментальные доказательства, что рекомбинантные антигены из различных возбудителей инфекций эффективно синтезируются в растениях в их природных формах, т. При употреблении таких растений в пищу рекомбинантные антигены могут индуцировать иммунный ответ . Некоторые из таких пищевых вакцин прошли клинические испытания и показали хорошие результаты . Далее мы уделим особое внимание конструированию ДНКвакцин, как наиболее перспективному направлению в области вакцинопрофилактики и вакцинотерапии. В последние лет сформировалось и получило интенсивное развитие новое направление в области вакцинопрофилактики и генотерапии это так называемая ДНКвакцинация или ДНКтерапия. Новые виды вакцинации и генотерапии основаны на транзиентной, т. Достаточно полная информация по этому направлению исследований была дана в обзоре В. Г. Дебабова . ДНК плазмид или вирусов, не способных к репликации в клетках животных и человека, длительное время сохраняется внутри клетки, не встраиваясь в геном, но поддерживая синтез кодируемых ею белков в течение недель и месяцев. То же относится к РНКсодержащим вирусам. После разработки относительно безопасных векторных систем, повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот в ткани, и обнаружения длительной до года экспрессии чужеродной ДНК в трансфецированных клетках i viv стал ясен потенциал этой технологии в генотерапии и создании вакцин. Все до сих пор используемые способы вакцинации связаны с введением в организм антигенов это могут быть убитые или живые аттенюированные вирусы и бактерии, или очищенные белки, или даже пептиды. В случае ДНКвакцинации в организм вводится не чужеродный белок, а ДНК или РНК, кодирующие этот белок, причм нуклеиновые кислоты, как хорошо известно, являются иммунологически инертными соединениями для организма, т. Прежде всего следует отметить, что исторически первыми шагами в области создания рекомбинантных ДНКвакцин можно считать манипуляции с вирусом бычьей папилломы V, о которых упоминалось выше см. В г. Вульфом и соавт. ДНК в физиологическом растворе в мышцу мыши приводит к поглощению этой ДНК клетками и к длительной экспрессии кодируемого плазмидой репортерного гена. В качестве репортерного гена была выбрана люцифераза, экспрессируемая под контролем промотора цитомегаловируса . После ДНКвакцинации у животных вырабатываются антитела , vi, , . ДНКвакцинация приводит к полноценному иммунному ответу, т. Тлимфоцитов клеточный ответ . Авторы использовали плазмиду, кодирующую внутренний белок вируса гриппа человека, и защитили мышей не только от штамма вируса, из которого взят ген , но и от другого штамма, выделенного из природы более чем через лет после первого. Такая перекрестная защита дает возможность думать об универсальной антигриппозной вакцине . Последняя из названных работ, повидимому, вызвала особый интерес у вакцинологов и стимулировала бурное развитие исследований в этой новой области. ДНК в клетки. Каковы же результаты этих исследований на сегодняшний день Прежде всего, относительно вопроса безопасности для организма поглощнной ДНКвакцины. В экспериментах на мышах, которым внутримышечно вводили плазмидную ДНК, последняя оставалась в месте инъекции на протяжении всего времени эксперимента недель и не обнаруживалась ни в хромосомной ДНК, ни в других тканях . Поскольку обнаружение этой ДНК проводили высокочувствительным методом ПЦР, было сделано заключение, что распространения ДНК по тканям всего организма не происходит. Интеграция же ДНК в хромосому если и происходит, то с очень низкой частотой, на три порядка меньшей, чем спонтанный мутагенез. Тем не менее, определнная вероятность инсерционного мутагенеза и активации протоонкогенов не исключена, и это пока является основным препятствием широкого внедрения метода в практическую медицину. Хотя если строго научно подходить к этому вопросу, то не меньшими, если не большими потенциальными возможностями индукции инсерционного мутагенеза и активации протоонкогенов обладают многие ДНКсодержащие вирусы адено и герпесвирусы, вирусы папилломы и др. ДНКсодержащих вирусов. Механизмы поглощения ДНК клетками организма исследуются, но полной ясности в этом вопросе нет.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.196, запросов: 145