Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов

Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов

Автор: Смирнов, Александр Владимирович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 205 с. ил.

Артикул: 4413945

Автор: Смирнов, Александр Владимирович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Особенности структуры 5 рРНК, е взаимодействия с макромолекулами и возможные функции.
1. Общие сведения о 5 рРНК.
2. Особенности структуры 5 рРНК
2.1. Спираль I .
2.2. Спираль II.
2.3. Петли В и С
2.4. Спираль III
2.5. Спирали IV и V и петля .
2.6. Петля Е
Петля Е бактериалыюго типа.
Петля Е эукариотического типа
2.7. Конформационная подвижность и реорганизация структуры 5 рРНК
3. Взаимодействия с биологическими макромолекулами
3.1. Взаимодействие с транскрипционным фактором III
3.2. Взаимодействия с рибосомными белками еЬ5Ы8ссмейства
3.3. Взаимодействие с рибосомным белком 5 прокариот
3.4. Взаимодействие с бактериальным рибосомным белком .
3.5. Взаимодействие с рРНК
4. Функции 5 рРНК
5. Импорт 5 рРНК в митохондрии клеток млекопитающих
Возможная роль 5 рРНК в митохондриях млекопитающих.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Штаммы . i и линии клеток человека.
1.1. Штаммы . i.
1.2. Линии клеток человека
2. Генноинженерные конструкции
2.1. Генноинженерные конструкции для клонирования и экспрессии генов версий 5 рРНК
2.2. Генноинженерные конструкции для экспрессии генов .
3. Моделирование вторичных структур версий 5 рРНК i ii.
4. Генноинженерные методы .
4.1. Создание генов мутантных версий 5 рРНК
ПЦРмутагенез генов 5 рРНК
Клонирование генов 5рРНК
4.2. Клонирование генов
ПЦРамплификация генов
Клонирование генов преМКР1А
5. Экспрессия мутантных версий 5 рРНК.
5.1. Экспрессия мутантных версий 5 рРНК i vi.
ПЦР генов мутантных версий 5 рРНК.
Рестрикция ПЦРпродуктов.
транскрипция
5.2. Экспрессия мутантных версий 5 рРНК i viv
Стабильная трансфекция человеческих клеток генами мутантной
5 рРНК
Выделение тотальной РНК из трансфицированных клеток
Обратная транскрипция с последующей ПЦР ОТПЦР.
6. Экспрессия генов белков.
6.1. Экспрессия генов в клетках Е. i.
6.2. Экспрессия генов белков в бесклеточиой сопряжнной системе
транскрипциитрансляции
ПЦР генов белков.
Бесклеточная сопряжнная система транскрипциитрансляции.
7. Анализ конформации 5 рРНК.
7.1. Нативный гельэлектрофорез.
7.2. Фрстеровский резонансный перенос энергии в геле
Сборка и гельэлектрофорез 5 рРНК
Количественный анализ данных в геле
8. Методы, использованные в экспериментах с роданезой.
8.1. Характеристика фермента и хранение.
8.2. Определение энзиматической активности
8.3. Денатурация
8.4. Термоинактивация.
8.5. Реактивация
8.6. Агрегация
8.7. Измерение УФспектров роданезных форм
8.8. Вестернблот анализ
Гельэлектрофорез белков по Лэммли
Вестернблоттинг
8.9. Иммунодеплетирование роданезы из белковых экстрактов
9. Анализ РНКбелковых взаимодействий.
9.1. Задержка в геле.
9.2. Анализ по Скэтчарду
9.3. НорсВестерн блоттинг
. Котрансляционное взаимодействие между роданезой и 5 рРНК
.1. Флуоресцентное мечение 5 рРПК
.2. Реакция котрансляционноо связывания.
. Импорт белков и 5 рРНК в выделенные митохондрии человека
.1. Выделение митохондрий из клеток человека
.2. Импорт белков в выделеннные митохондрии.
.3. Импорт 5 рРНК в выделенные митохондрии человека
Выделение и фракционирование белков, направляющих импорт 5
Дефосфорилирование Т7транскриптов 5рРНК.
Меченые транскриптов
Реакция импорта 5рРНК в выделенные митохондрии.
Расчт эффективности импорта версий 5 рРНК в выделенные митохондриил
. Импорт 5 рРНК i viv.
.1. Импорт мутантных версий 5 рРНК в митохондрии стабильно трансфицированных человеческих клеток
.2. Импорт мутантных версий 5 рРНК в митохондрии человеческих
клеток, трансфицированных транскриитами.
Трансфекция человеческих клеток транскриптами.
Норзернблот гибридизация.
Расчт эффективности импорта версий 5 рРНК в митохондрии i
. Ингибирование экспрессии генов роданезы и с помощью РНКинтерференции
. Анализ экспрессии митохондриальных белков i viv
. Выделение и анализ митохондриальных рибосом
.1. Выделение и Норзернблот анализ грубого препарата митохондриальных рибосом.
Выделение грубого препарата миторибосом печени крысы
Норзернблот анализ РНК из грубого препарата миторибосомЛ
.2. Фракционирование митохондриального лизата печени крысы на сахарозном градиенте.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Детерминанты импорта 5 рРНК в митохондрии клеток человека
1.1. Стратегия поиска детерминант импорта.
1.2. Роль главных доменов в импорте 5 рРНК.
1.3. Влияние делеций в домене р на эффективность импорта 5 рРНК i vi
1.4. Влияние мутаций в домене у на эффективность импорта 5 рРНК i vi.
1.5. Влияние мутаций в домене а и петле А на эффективность импорта 5 рРНК i vi
1.6. Анализ двойных мутантов 5 рРНК по доменам а и у.
1.7. Анализ импорта мутантных версий 5 рРНК в человеческие митохондрии i viv.
1.8. Возможный механизм регуляции распределения 5 рРНК в эукариотической клетке
1.9. 5 рРНК как вектор.
2. Факторы импорта 5 рРНК в митохондрии клеток человека.
2.1. Получение и анализ белковых фракций, направляющих импорт 5 рРНК i vi.
2.2. Роданеза как фактор импорта
2.3. Взаимодействие роданезы с 5 рРНК
2.4. 5 рРНК как шанерон для роданезы.
Анализ конформации 5рРНК человека в растворе
Конформационноспецифичный шаперонный эффект 5 рРНК.А Конформагрт роданезы в комплексе с 5рРНК
2.5. как 5 рРНКсвязывающий фактор.
2.6. как фактор импорта 5 рРНК
2.7. Система преМЛРЫВродапеза как молекулярный конвейер
Взаимодействия 5 рРНК с роданезой и 8 в
минимальной системе импорта
Математическая модель, описывающая конвейерный механизм
передачи 5рРНК
Взаимодействия 5 рРНК с митохондриальными формами роданезы и
2.8. Система импорта 5 II i viv.
3. Возможная функция 5 рРНК в митохондриях млекопитающих
Необходимость импортированной 5 рРНК для поддержания
митохондриальной трансляции
Импортированная 5 рРНК как компонент миторибосомы
млекопитающих
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ранние этапы эволюции рибосомы.
Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант I протисты. 5 Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант II растения и
животные.
Развитие механизма импорта 5рРНК в митохондрии
ПреМВРЬ как первый фактор импорта.
Роданеза как второй фактор импорта или один из вторых
факторов.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Внутренние и терминальные петли, выпетливания отдельных нуклеотидов, протяжнные участки неканонического спаривания оснований и ряд других структурных особенностей формируют уникальный рельеф поверхности 5 рРНК, где многочисленные области расширения большой бороздки экспонируют множество химических групп, которые могут участвовать во взаимодействиях с другими макромолекулами. Как всякая РНК в клетке, 5 рРНК всегда связана с тем или иным белковым фактором. От белкового компонента комплекса зависит не только стабильность 5 рРНК, но и направление е перемещения внутри клетки. Из всех известных РЫК 5 характеризуется, пожалуй, наиболее сложными путями транспорта Рис. Дело в том, что, в отличие от генов прочих рРНК, транскрипция генов 5 рРНК эукариот не связана с ядрышком, поэтому необходимо какимто образом доставить этот компонент к месту сборки рибосомных субчастиц. Сначала новосинтезированная 5 связывается с транскрипционным фактором III, который до этого принимал активное участие в е появлении на свет транскрипция генов 5 рРНК требует помимо РНКполимеразы III присутствия трх транскрипционных факторов III, III и III. Полученный таким образом комплекс покидает ядро и выходит в цитозоль. Здесь 5 рРНК может некоторое время накапливаться в виде того же комплекса например, в ооцитах X vi i , либо в составе более сложных мультикомпонен тных РНП, включающих ряд белков, гомологичных III, некоторые аминоацилтРНКсинтетазы и тРНК i . Однако для проникновения в ядрышко 5 рРНК должна связаться с другим партнром рибосомным белком 5. Белок 5, равно как и его прокариотический гомолог , является основным 5 рРНКсвязывающим белком в рибосоме. Белки еЬ5Ы8ссмейства присутствуют у всех организмов и абсолютно необходимы для включения 5 рРНК в состав большой субчастицы. Рибосомы прокариот, помимо, содержат, по крайней мере, ещ один 5 рРПКсвязывающий белок 5 несмотря на сво название, совершенно не родственный 5 эукариот. Наконец, во многих бактериальных рибосомах 5 рРНК взаимодействует ещ и с третьим белковым фактором . Все вместе, 5 рРНК и ассоциированные с ней рибосомные белки формируют основную часть центрального протуберанца большой субчастицы. Функциональная роль 5 рРНК в рибосоме до сих пор не ясна. Известно, что в е отсутствие трансляция на бактериальных рибосомах становится невозможной . Несмотря на это, многочисленные попытки обнаружить 5 рРНК в миторибосомах многоклеточных животных, грибов и трипаносоматид не увенчались успехом, что ставит под сомнение е необходимость и незаменимость для биосинтеза белка. РНК через многочисленные РНКбелковые и РНКРНК взаимодействия выполняет роль связующего звена между функциональными центрами рибосомы, координируя их активности, обеспечивая слаженность их работы iiv . В пользу этой точки зрения свидетельствуют многочисленные факты как теоретического, так и экспериментального плана, хотя в целом вопрос о функциональной роли 5 рРНК вс ещ остатся открытым. Цитоэопьн. Рис. Схема внутриклеточных перемещений эукариотической 5 рРНК. Спираль I Рис. За длиной 9 н. С пар высокое соотношение характерно для всей молекулы 5 рРНК и никогда не бывает меньше 1. С одной стороны спираль I оканчивается 5 и 3 терминальными участками молекулы, которые часто не спарены на концах или имеют разную длину при этом 5конец обычно заглублен. С другой стороны она обращена к петле А. Одна из характерных особенностей спирали I повышенное относительно других модулей молекулы количество, пар, часть из которых являются некомпенсированными то есть в 5направлении от остатка гуанина находится пиримидиновый нуклеотид. Например, в подавляющем большинстве случаев пара является некомпенсированной, в то время как всегда компенсирована i . Присутствие некомпенсированных пар приводит к локальным деформациям спирали изза неэффективного стэкинга i . РНКбслкового узнавания. Необходимо отметить, что в поддержании третичной структуры этой спирали также участвуют молекулы воды. Отчасти именно они стабилизируют пары адомена. Функциональное значение спирали I довольно велико. Е специфическая вторичная и третичная структуры играют важную роль в стабилизации молекулы и возможности е интшрации в рибосому.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.186, запросов: 145