Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli.

Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli.

Автор: Манувера, Валентин Александрович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 137 с. ил.

Артикул: 4348946

Автор: Манувера, Валентин Александрович

Стоимость: 250 руб.

Оглавление
1 Введение.
2 Трансмембранный транспорт белков у бактерий.
2.1 Истинная секреция у грам отри дательных бактерий
2.2 система трансмембранной транслокации белков у бактерий
2.2.1 Адресация синтезируемых полипептидов втранслоказу.
2.2.1.1 Структура сигнальной последовательности субстратов
транслоказы
2.2.1.2 Адресация при участии
2.2.1.3 Адресация при участии шаперона
2.2.1.4 Взаимоотношение и зависимых способов
адресации
2.2.2 Структура и функции транслоказы.
2.2.2.1 Стехиометрия компонентов транслоказы.
2.2.2.2 молекулярный мотор транслоказы
2.2.2.3 Трансмембранный комплекс кор транслоказы
2.2.2.4 Роль транслоказы в биогенезе мембранных белков.
2.2.2.5 Сигнальные пептидазы первого типа .
2.2.2.6 Общая схема функционирования системы транслокации
2.2.3 Образование транслоцированными полипептидами нативной
конформации в периплазме
2.3 ТАТсистема трансмембранной транслокации белков у бактерий
2.3.1 Сигнальные пептиды субстратов ТАТсистемы.
2.3.2 Структурные компоненты ТАТсистемы
2.3.3 Особенности функционирования ТАТсистемы транслокации.
2.4 Использование трансмембранного транспорга при получении
рекомбинантных белков.
3 Энтеротоксины .
3.1 Структура стафилококковых энтеротоксинов
3.1.1 Пространственная структура
3.1.2 Взаимодействие с молекулами II II
3.1.3 Связывание с
3.2 Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе
3.2.1 Стафилококковые пищевые отравления
3.2.2 Синдром токсического шока .
3.3 Медицинское значение энтеротоксинов .
3.3.1 Усиление специфичного иммунного ответа
3.3.2 Терапия опухолей.
3.3.3 Создание вакцин против стафилококковых энтеротоксинов.
3.3.4 Перспективы медицинского применения стафилококковых
энтеротоксинов
4 Материалы и методы
4.1 Материалы.
4.1.1 Реактивы
4.1.2 Ферменты
4.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды.
4.1.4 Микробиологические среды
4.1.5 Олигонуклеотиды.
4.2 Методы
4.2.1 Полимеразная цепная реакция.
4.2.2 Выделение хромосомной ДНК .
4.2.3 Операции с ДИК
4.2.4 Электрофоретическое разделение белков.
4.2.5 Иммуноблот
4.2.6 Фракционирование клеток .i
4.2.7 Очистка рекомбинантного с помощью ионообменной хроматографии.
4.2.8 Очистка рекомбинантных и с помощью аффинной
хроматографии.
5 Результаты и обсуждение.
5.1 Клонирование генов, кодирующих и . Изучение их экспрессии в
. i.
5.1.1 Получение плазмид для экспрессии и в .i.
5.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных и в клетках .i
5.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации энтерогоксина А первичной структуры его сигнального пептида.
5.2.1 Конструирование форм энтеротоксииа А с измененным сигнальным пептидом и исследование накопления рекомбинантных белков в клетках .i
5.2.2 Вероятный механизм влияния исследованных вариантов аминокислотных замен в сигнальном пептиде на его функцию
5.3 Очистка рекомбинантных и
5.3.1 Очистка путем ионообменной хроматографии
5.3.2 Биологическое тестирование очищенного препарата .
5.3.3.Очистка и путем аффинной хроматографии.
5.3.3.1 Получение форм и , несущих Сконцевой гексагистидиновый мотив
5.3.3.2 Проведение аффинной хроматографии
5.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации
рекомбинантных белков в периплазматическое пространство .i на
модели энтеротоксинов из .
5.4.1 Клонирование 1ена, кодирующего ТогА и исследование его внутриклеточной локализации при гиперэкспрессии в .i.
5.4.2 Конструирование плазмид для исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков
5.4.3 Исследование накопления гибридных белков в клетках .i
5.4.4 Возможные механизмы взаимного влияния сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса транслокации
6 Выводы.
7 Список литературных источников.
Список сокращений
ЛЬ антитело
А антиген
АРС антигснпрезентующая клетка
АТ авто транспортеры система секреции пятого типа
В8А бычий сывороточный альбумин
С система секреции типа шаперон привратник
вЗР основной главный секреторный путь
1РЫ интерферон
1Ь интерлейкин
кВа, кДА килодальтон
ЬРБ липополисахариды
МНС главный комплекс гистосовмсстимости
нвп нуклеотидсвязывающий домен
РИ дисульфидизомераза белков
РР пептидилпролил с.ушшизомеразы
комплекс рибосомы, растущей полипептидной цепи и сигналраспознающей частицы
8А суперантиген, суперантигены
БСрУ одноцепочечное миниантигело
БОБ додецилсульфат натрия
ЭЕ стафилококковые энтеротоксины
8ЕА, 8ЕВ, 8ЕС и т.д. стафилококковый энтеротоксин А, В, С и т.д.
8ЕР стафилококковые пищевые отравления
8Р сигнальный пептид
8Раэе сигнальная пептидаза
8ЯР Сигнапраспознающая частица
Б субстратспецифичный домен
Т8Т8 системы секреции первого четвертого типа
ТСЯ Тклеточный рецептор
ТЕ триггерный фактор
ТМ8 трансмембранный сегмент
фактор некроза опухолей
ТР8 система секреции типа 5Ь
Тга трисгидроксимстиламинометан
ТББ синдром токсического шока
ТТ1 токсин синдрома токсического шока
ДцН протонный трансмембранный потенциал
а.о. аминокислотный остаток
п.н. пара нуклеотидных остатков
ПААГ полиакриламидный гель
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
В работе использованы стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот и однобуквенные обозначения нуклеотидов.
Написание названий эндонуклеаз рестрикции приводится согласно 1 и не содержит курсивного выделения.
1 Введение
Бактериальная клетка отделена от внешней среды плазматической мембраной, основу которой составляет гидрофобный двойной слой липидов. Основополагающая функция мембраны барьерная. Она отделяет содержимое клетки от окружающей среды, делая возможным поддержание гомеостаза и защищая от внешних воздействий. При этом, мембрана работает как высоко селективный фильтр, избирательно пропуская одни соединения, задерживая другие и активно перемещая третьи. Задачи транспорта решаются целым рядом селективных белковых каналов и активных транспортеров, ассоциированных с мембраной.
Для нормального функционирования клетки необходимо перенести через плазматическую мембрану или встроить в нее большое количество различных белков. Задачу по перемещению через гидрофобный слой высокомолекулярных полипептидных субстратов решают специальные системы, состоящие из большого количества компонентов и утилизирующие производимую клеткой энергию в виде нуклеозидтрифосфатов иили трансмембранного электрохимического потенциала 2. Основная система трансмембранного транспорта белков Бестранслоказа. С с помощью происходит выведение из цитоплазмы наружу несвернутых полипептидов или их встраивание в мембрану. Открытая позднее ТАТсистема позволяет преодолевать мембранный барьер белкам, имеющим нативную третичную или даже четвертичную структуру 3.
Актуальность


В процессе размножения в организме млекопитающих, данный микроорганизм секретирует большое количество энтеротоксинов нескольких типов 4. По механизму действия они относятся к группе так называемых суперантигенов белков, вызывающих неспецифическую активацию больших субпопуляций Тлимфоцитов. Их главная задача подавление иммунного ответа организмахозяина 4. Действием стафилококковых энтеротоксинов обусловлен ряд заболеваний, в том числе пищевые отравления и синдром токсического шока 4. Особенности воздействия стафилококковых энтеротоксинов на иммунную систему человека делают их потенциальным объектом для создания медицинских препаратов различного назначения иммуностимуляторов, усилителей иммунною ответа при вакцинации, компонентов противоопухолевых лекарств см. В настоящее время стафилококковые энтеротоксины, в том числе и рекомбинантные, получают, в основном, из культур Данный микроорганизм одновременно продуцирует большое количество различных токсинов, поэтому получение препарата со степенью очистки, допускающей медицинское применение, связано со значительными трудностями. Поскольку генноинженерные методы для . Нами было показано, что аутентичные сигнальные пептиды ряда стафилококковых энтеротоксинов обеспечивают транспорт этих белков в периплазму при гетерологичной экспрессии в клетках . Несмотря на сходство пространственной структуры, разные типы стафилококковых энтеротоксинов имеют идентичность аминокислотной последовательности лишь около 5 и различные по структуре сигнальные пептиды. Данное обстоятельство позволило нам использовать полученные рекомбинантные токсины в качестве модели, комбинируя различные лидерные последовательности и зрелые части белков, заведомо способных к переносу в перплазмагическое пространство . Подобный подход мы использовали для ответа на вопросы о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной траислокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми. Цели и задачи работы. ДНК, кодирующие стафилококковые энтеротоксины А и В и получить экспрессионные плазмиды для . А и В в . А, В, Н из . Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые получены штаммы . А и В в растворимой форме. Показано, что аутентичные сигнальные пептиды данных белков обеспечивают их локализацию в периплазме при гетерологичной экспрессии в . Отработана высокотехнологичная хроматографическая методика выделения и и получены очищенные препараты данных белков. Сконструирован ряд гибридных полипептидов и исследована их локализация в клетках . Практическая значимость. Практическая значимость данной работы заключается в двух аспектах. Вопервых, полученные штаммыпродуценты и могут быть использованы для наработки препаратов данных белков в значительных количествах без использования в работе патогенных культур При этом открываются широкие возможности по модификации данных токсинов, генетическому и химическому коныогироваиию их с другими белками. Это, в свою очередь, позволяет проводить исследования воздействия энтеротоксинов на иммунную систему млекопитающих и их противоопухолевой активности. В перспективе, модифицированные токсины могут найти практическое применение в медицинской практике данному направлению в настоящее время уделяется большое внимание при конструировании противоопухолевых препаратов нового типа. Вовторых, проведенные исследования влияния сигнальных пептидов па трансмембранный транспорт модельных белков позволяют определить несколько направлений анализа структурнофункциональных взаимоотношений в системе сигнальный пептид секретируемый полипептид. Результаты, полученные в данной работе закладывают хорошую базу для дальнейших исследований в данной области, которые могут помочь в поиске путей оптимизации переноса рекомбинантных белков в периплазму . Периплазмаическая локализация существенно облегчает выделение и очистку рекомбинантных белков, а также позволяет существенно уменьшить проблемы, связанные с токсичностью продукта для продуцирующих его клеток и, в значительной степени, с образованием телец включения.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.185, запросов: 145