Клонирование генов вне клетки

Клонирование генов вне клетки

Автор: Саматов, Тимур Рустэмович

Количество страниц: 114 с. ил.

Артикул: 2937172

Автор: Саматов, Тимур Рустэмович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Стоимость: 250 руб.

СОДЕРЖАНИЕ
Использованные сокращения.
ВВЕДЕНИЕ
1. Обзор литературы.
1.1. Подходы i viv методы, использующие клетки
1.1.1. Фаговый дисплей
1.1.2. Дисплей на поверхности клеток
1.1.3. Пептиды на плазмидах.
1.1.4. Преимущества и недостатки дисплеев i viv.
1.2. Подходы i vi бесклеточные методы.
ф 1.2.1. Дисплеи, где белок связан с РНК
1.2.1.1. Нековалентная связь мРНК с белком
1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком
1.2.2. Дисплеи, где белок связан с ДНК
1.2.3. I vi компартментализация.
1.2.3.1. Простая эмульсия.
1.2.3.2. Двойная эмульсия.
1.2.3.3. Особенности метода i vi компартментализации
ф 1.2.4. Преимущества и недостатки дисплеев i vi
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы .i и плазмиды.
2.1.1. Штаммы .i
2.1.2. Плазмиды.
2.2. Микробиологические среды.
2.3. Трансформация клеток .i
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.4.1. Грубое выделение плазмидной ДНК.
2.4.2. Очистка плазмидной ДНК при помощи кипячения в присутствии
Мд2 и ТрисНС1 9,0.
2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК.
2.5. Выделение РНК из светляка исоа ттдгеНса.
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот и белков.
2.6.1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях
2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях.
2.6.2.1. В денатурирующих условиях
2.6.2.2. В неденатурирующих условиях
2.6.3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия
2.7. Саузернблот анализ
2.7.1. Перенос ДНК из геля на мембрану.
2.7.2. Гибридизация с меченым зондом.
2.8. Определение концентрации белка.
2.9. Выделение и очистка термостабильных ДНКзависимых ДНКполимераз
2.9.1. Получение препарата ЫвРиюполимеразы.
2.9.2. Получение препарата Н1эбГадполимеразы.
2 Ферментативные реакции
. Рестрикция.
. Обратная транскрипция синтез кДНК
. Транскрипция.
. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2 Получение экстракта зародышей пшеницы.
. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением.
. Разрушение зародышей пшеницы
. Гельфильтрация экстракта зародышей пшеницы.
2 Совмещенная транскрипциятрансляция i vi
. Транскрипциятрансляция в системе на основе экстракта Е.соН
. Транскрипциятрансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы
2 Метод молекулярных колоний
. Подготовка полиакриламидных гелей.
. Полимеразная цепная реакция в геле
. Транскрипция в геле.
. Совмещенная транскрипциятрансляция в геле
. Обнаружение колоний ДНК и РНК.
.1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану
.2. Гибридизация с меченым зондом.
. Детекция белков, синтезированных в геле.
.1. Детекция по включению радиоактивной метки.
.2. Детекция флуоресценции
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Цели и экспериментальные задачи
3.2. Разработка ПЦРверсии метода молекулярных колоний
3.2.1. Выбор иммобилизованной среды.
3.2.2. Смесь термостабильных ДНКполимераз
3.2.3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану.
3.2.4. Размножение генов обелина и в виде молекулярных колоний
3.3. Клонирование i vi кДНК люциферазы
3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле
3.3.2. Отбор и размножение молекулярных клонов.
3.4. Транскрипция в молекулярных колониях
3.5. Синтез белка в молекулярных колониях
3.5.1. Выбор системы транскрипциитрансляции
3.5.2. Транскрипциятрансляция в геле
3.5.3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипциитрансляции и ее решение
3.5.4. Экспрессия гена в молекулярных колониях
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Истинно молекулярное клонирование генов
4.1.1. Преимущества бесклеточного клонирования.
4.1.2. Ген люциферазы от светляка до индивидуальных молекулярных клонов
4.2. Экспрессия генов в молекулярных колониях.
4.2.1. Новая разновидность генетического дисплея.
4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле
4.3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки
4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний
4.3.2. Изотермические системы размножения генов
4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов.
ВЫВОДЫ.
Цитированная литература
Использованные сокращения
бисакриламид М,1Гметиленбисакриламид БСА бычий сывороточный альбумин
Да дальтон единица молекулярной массы, равная массе атома водорода
ДНК 2дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНКДНКкопия РНК
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
Трис трисоксиметиламинометан
ТХУ трихлоруксусная кислота
А аденин или остаток адениловой кислоты
С цитозин или остаток цитидиловой кислоты
ЭТТ дитиотрейтол
бЫТР дезоксирибонуклеозид5трифосфаты Ы А, С, в, Т
ЕЭТА этилендиаминЫ.Ы.Ы.Ытетрауксусная кислота
О гуанин или остаток гуаниловой кислоты
вБР зеленый флуоресцирующий белок
НЕРЕБ Ы2оксиэтилпиперазинМ2этансульфоновая кислота
1РТС изолролилтиогалактопиранозид
ЫТР рибонуклеозид5трифосфаты
РМЭБ параметилсульфонилфторид
БРв додецилсульфат натрия
Т тимин или остаток тимидиловой кислоты
ТЕМЕО Ы.Ы.Н.ЫЧетраметилэтилендиамин
и урацил или остаток уридиловой кислоты
ВВЕДЕНИЕ


На сегодняшний момент все большее применение находят и большее значение приобретают методы i vi. По сравнению с подходами i viv, они имеют существенные преимущества позволяют исследователю в большей степени менять и контролировать условия эксперимента, они быстрее и их проще автоматизировать, они позволяют избежать ограничений, накладываемых живыми клетками и векторами, соответственно, здесь меньше выражен естественный отбор и, наконец, они позволяют работать с большим разнообразием последовательностей нуклеиновых кислот и белков. Однако среди всего многообразия подходов i vi нет метода, который позволил бы провести экспрессию наборов РНК и ДНК, их скрининг по свойствам синтезированного продукта и в результате получить индивидуальные последовательности то есть выделить клоны. Необходимо отметить, что к настоящему моменту все же описан ряд экспериментальных бесклеточных подходов, с использованием которых в принципе возможно получить индивидуальные клоны. Эти подходы основаны на той идее, что если сильно разводить экспериментальный образец, то рано или поздно в одном сортировочном компартменте это может быть, например, реакционная ячейка, элемент микрочипа, микрошарик или капля водномасляной эмульсии окажется единичная молекула исследуемой библиотеки. Однако это вовсе не означает, что результатом такой селекции всегда будет истинный молекулярный клон, и сами разработчики этих методов вынуждены в каждом случае проверять чистоту полученных клонов при помощи обычного клонирования с использованием векторов и живых клеток. В результате потомство каждой исходной молекулы концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, образуя колонию. Такая колония по сути и является молекулярным клоном. Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована возможность клонировать таким образом молекулы РНК, размножая их с помощью репликазы vi vi, . Целью данной работы было создание версии метода молекулярных колоний, позволяющей клонировать молекулы ДНК, в том числе целые гены, а также разработка метода экспрессии генов в молекулярных колониях. Данная работа была выполнена в Лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Автор искренне благодарит сотрудников Лаборатории Е. В. Четверину, В. И. Угарова, М. В. Фалалееву, З. В. Валину, Е. А. Узлову и технический персонал за помощь в планировании и проведении экспериментов, обучение и критическое обсуждение результатов. Автор благодарен Е. С. Высоцкому Институт биофизики, Красноярск, В. Н. Ксензенко Институт белка РАН, С. Дабровски и Й. Куру Технический университет Гданьска, Польша, а также Угаровой Московский Государственный Университет за предоставление генетического материала, использованного в работе. Автор признателен Л. А. Шалойко филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино, В. А. Яшину Институт биофизики клетки РАН, Пущино, а также сотрудникам Института белка РАН Минину и В. А. Широкову за помощь в проведении некоторых предварительных экспериментов. Особую признательность автор выражает своему научному руководителю А. Б. Четверину за искренний интерес, постоянное внимание и прекрасную школу научной работы. Фаговый дисплей Одним из наиболее широко используемых i viv дисплеев является фаговый дисплей i, . Суть этого подхода заключается в том, что исследуемые участки ДНК встраивают в ген i нитевидного фага типа 1. Этот ген кодирует малый белок оболочки, находящийся на одном конце вирусной частицы. Чужеродная аминокислотная последовательность оказывается между двумя доменами этого белка, не нарушая при этом его функции. Таким образом, изучаемый фенотип и соответствующий ему генотип находятся в одной вирусной частице. Кроме этого, поскольку она представляет собой жизнеспособный вирус, то вместе с ним возможно реплицировать и выбранную последовательность. Этот подход чаще всего используется для селекции пептидов, способных специфически связываться с определенными лигандами, иммобилизованными на подложке рис. Позднее были разработаны схемы отбора генов по каталитическим функциям белковых продуктов .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.173, запросов: 145