MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования

MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования

Автор: Владыченская, Ирина Петровна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Москва

Количество страниц: 110 с. ил.

Артикул: 2634406

Автор: Владыченская, Ирина Петровна

Стоимость: 250 руб.

1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы б
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна
1.4. Практическая значимость работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Поиск новых генов
2.1. Биохимические методы
2.1.1. Традиционный подход к выявлению новых генов
2.1.2. Обратная генетика еще один подход к поиску
новых генов
2.1.2.1. Позиционное клонирование
2.1.2.2. Анализ клонотек кДНК и поиск генов тканеспецифических белков
2.1.2.3. Глобальные методы исследования экспрессии и
их вклад в обнаружение новых генов
2.1.2.3.1. Поиск новых генов с помощью метода дифференциального дисплея мРНК
2.1.2.3.2. Поиск новых генов при помощи экспрессионных ДНКмикрочипов
2.2. Компьютерные методы
2.2.1. Секвенирование генома человека и совершенствование методов биоинформатики возможность принципиально нового подхода к поискам генов
2.2.2. Использование базы данных экспрессирующихся последовательностей для поиска новых генов
2.2.2.1. Глобальные стратегии поиска новых генов
i ii, или количественный поиск
2.2.2.1.1. Использование последовательностей клонотек кДНК для клонирования i ii
2.2.2.1.2. Клонирование i ii путем сопоставления протяженных геномных последовательностей с последовательностями
2.2.2.2. Направленный поиск генов, или качественный
поиск
2.2.3. Уточнение структуры генов компьютерными методами
2.2.3.1. Определение экзонинтронной структуры генов
2.2.3.2. Поиск альтернативных продуктов транскрипции
генов, клонированных i ii
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Клонирование последовательности кДНК НшоЬЗЗ
3.1.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и векторы для
клонирования
3.1.2. Среды и растворы
3.1.3. Выделение однонитевой формы ДНК бактериофагов
М шр и М шр
3.1.4. Выделение двунитевой формы ДНК
бактериофагов М тр и М тр
3.1.5. Выделение ДНК рекомбинантной плазмиды
со вставкой клона НшоЬЗЗ
3.1.6. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК
3.1.7. Клонирование фрагментов последовательности
НтоЬЗЗ в ДНК бактериофага М
3.1.7.1. Препаративное разделение фрагментов ДНК
в агарозном геле
3.1.7.2. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
и их последующая очистка
3.1.7.3. Обработка препаратов векторной ДНК бактериальной щелочной фосфатазой
3.1.7.4. Получение рекомбинантных молекул фага М
3.1.7.5. Получение компететных клеток
3.1.7.6. Трансформация компетентных клеток
3.2. Определение первичной структуры клона НтоЬЗЗ
методом секвенирования по Сэнгеру
3.3. Электрофоретическое фракционирование
продуктов реакции секвенирования ДНК
3.4. Локализация последовательности клона НтоЬЗЗ
на хромосомах человека
3.4.1. Олигонуклеотидные праймеры
3.4.2. Условия амплификации
3.4.3. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР
3.5. Выделение РНК из тканей человека
3.5.1. Выделение тотальной РНК
3.5.2. Получение полиаденилированной фракции мРНК хроматографией на микроколонках
с олигоцеллюлозой
З.б. Нозернблот гибридизация
3.6.1. Фракционирование образцов в агарозном геле и
, перенос РНК на гибридизационный фильтр
3.6.2. Получение Рмеченого зонда
3.6.3. Гибридизация мРНК, иммобилизованной на фильтрах,
с меченым зондом
3.7. ОТПЦР
3.7.1. Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой I
3.7.2. Синтез одноцепочечной кДНК
3.7.3. Условия амплификации
3.7.4. Электрофорез продуктов ОТПЦР в ПААГ
3.8. Сауэернблот гибридизация
3.8.1. Фракционирование продуктов ОТПЦР в агарозном геле
3.8.2. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр
3.9. Секвенирование продуктов ОТПЦР
3.9.1. Элюция продуктов ОТПЦР из ПААГ
3.9.2. Автоматическое секвенирование
3 Удлинение праймера i xi
. Получение Рмеченого маркера и олигонуклеотидных праймеров
. Гибридизация меченых праймеров с полиА фракцией мРНК
ь . Реакция удлинения праймера
. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции удлинения праймера
3Компьютерные методы анализа
. ВЬАБТанализ нуклеотидных и аминокислотных
последовательностей
.1. Удлинение последовательности НтоЬЗЗ
.2. Поиск белковых последовательностей.
гомологичных гипотетическому белку
. Поиск и анализ предполагаемых
промоторных областей
. Поиск открытых рамок считывания и компьютерная
трансляция нуклеотидных последовательностей
. Анализ структуры предполагаемых белковых
продуктов
.1. Поиск трансмембранных доменов
.2. Выявление известных функциональных мотивов, присутвующих в послеовательности белка
. Выравнивание последовательнотей
белковгомологов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Определение нуклеотидной последовательности
клона НтоЬЗЗ
4.2. Локализация последовательности клона НтоЬЗЗ
на хромосомах человека
4.3. I ii анализ последовательности клона НтоЬЗЗ
и участка геномной последовательности, фланкирующего его с 3конца
4.4. I ii конструирование контига НМОВЗЗ
гипотетического транскрипта гена
4.5. I ii определение экзонинтронной структуры
предполагаемого гена
4.6. Анализ гипотетического транскрипта гена последовательности
4.7. Выявление транскриптов, соответствующих
предсказанному i ii гену ,
в тканях человека
4.8. Идентификация обнаруженных транскриптов гена
4.9. Определение первичной структуры двух транскриптов
гена
4Определение точек инициации транскрипции гена
л ii анализ участка геномной
последовательности, фланкирующего 5 конец
гена
4Анализ экспрессии гена в тканях человека
л ii определение и анализ предполагаемых белковых продуктов, кодируемых транскриптами гена
4Идентификация белка . Поиск и анализ последовательностей белков, паралогичных
4Выявление групп предполагаемых ортологов белков , и 2
4Оценка степени эволюционного консерватизма белков
, и 2
4Выявление функциональных мотивов,
характеризующих семейство белков
4Таблицы и рисунки
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Выявление всех генов человека, установление карты тканеспецифичности их экспрессии, построение картины их взаимодействия будут являться факторами, которые предопределят переход молекулярной биологии на новый, более высокий уровень уровень интегративного анализа Свердлов, , а также дадут более глубокое понимание природы физического и психического здоровья человека и откроют новые пути для развития медицины. V . В частности, анализ баз данных геномных и экспрессирующихся последовательностей человека, проводимый методами современной биоинформатики, позволяет вычленять последовательности, соответствующие отдельным генам, в их числе неизвестным ранее, а также получать информацию, касающуюся структуры и локализации этих генов. Особый интерес представляет идентификация и анализ генов, специфически экспрессирующихся в различных тканях и определяющих особенности их функционирования. Уникальным объектом исследования является головной мозг человека. Отличительным свойством этого органа является то, что в нем, по сравнению с другими органами, имеется наибольшее количество морфологически и функционально различающихся клеточных популяций. Они осуществляют разнообразные функции, для
реализации которых требуется множество белковых продуктов, и, следовательно, экспрессия очень большого числа генов. Таким образом, поиск новых генов и генных семейств, определяющих специфичность функционирования биохимических систем мозга и их регуляции, является актуальным направлением современной молекулярной биологии. Ранее в целях выявления генов, специфически экспрессирующихся в мозге человека, на основе полиаденилированной фракции РНК некоторых отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе НшоЬЗЗ клон из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, , последовательности которых экспрессировались преимущественно в головном мозге человека Буякова и соавт. Провести филогенетический анализ обнаруженного гена. Обнаружен неизвестный ранее ген человека ТМЕМ , гипотетический белковый продукт которого совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолинцерамид холинфосфотрансферазы 1 сфингомиелинсинтетазы 1. Впервые описана хромосомная локализация и геномная структура данного гена, а также охарактеризованы особенности организации транскрипта. Впервые исследована транскрипционная активность гена ТМЕМ и показано, что изучаемый ген экспрессируется в широком спектре тканей человека. РНК. Высказаны предположения о механизмах, регулирующих уровень активности гена ТМЕМ в организме. Выявлено неизвестное ранее древнее семейство генов, включающее в свой состав ТМЕМ, а также показана эволюционная консервативность белковых продуктов, кодируемых генами этого семейства. Результаты исследования гена ТМЕМ , позволившие идентифицировать два альтернативных транскрипта гена с преимущественной экспрессией в мозговых тканях человека, представляют большой интерес с позиций определения вклада отдельных генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге. Идентификация ТМЕМ как гена, кодирующего сфингомиелинсинтетазу I фермент, регулирующий мощность воздействия на клетку проапоптотичсского медиатора церамида, имеет большое значение для дальнейшего изучения механизмов регуляции процессов апоптоза клетки. Информация о структуре данного гена весьма значима для дальнейшего изучения особенностей его транскрипции. Сведения о характере организации мРНК ТМЕМ позволяют сформулировать гипотезу относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к изучению влияния 5 и Знетранслируемых областей на эффективность экспрессии этого гена. При возникновении необходимости изучения функциональных свойств гена ТМЕМ i viv методом его инактивации, информация о существовании белковпаралогов , один из которых, возможно, выполняет функции, сходные с функциями , позволит создать адекватную экспериментальную модель. Консервативность белкового продукта ТМЕМ в ряду ортологов предоставляет возможность достаточно широкого выбора модельных объектов для изучения роли сфингомиелинсинтетазы 1 в работе сфингомиелинового цикла.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.208, запросов: 145