Выделение и характеристика сайт-специфических эндонуклеаз из штаммов бактерий родов Bacillus и Staphylococcus

Выделение и характеристика сайт-специфических эндонуклеаз из штаммов бактерий родов Bacillus и Staphylococcus

Автор: Ширяев, Сергей Александрович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2001

Место защиты: Пущино-на-Оке

Количество страниц: 153 с. ил

Артикул: 329897

Автор: Ширяев, Сергей Александрович

Стоимость: 250 руб.



Были определены ах сайты узнавания и рестрикции на ДНК, а также изучены некоторые их свойства молекулярная масса оптимальные условия работы буфер для рестрикции, , 1С стабильность при хранении и температурной инактивации. ВхрЬА I, ВзрЬА П, Взр1Л Ш, ВхрМК I Ввр I. Разработан метод определения точек расщепления на ДНК в зависимости от нуклеотидного окружения сайга на примере эндонуклеаз БзрТ5 I и ВярР4 I. При расшифровке их сайтов узнавания н точек расщепления на ДНК выяснилось, что ферменты являются новыми эндонуклеазами II класса. Установили, что они узнают следующие сайты р I 5ЧЮТОАМ Вар4 I 5ЧНОЫСГСТ3 В настоящее время, разрабогатщая методика создания подобных конструкций и последующее их ссквенировамие, позволяют с высокой точностью определять сайты узнавания и рсстриктрш для любых сайтыкщифическюс эндонуклеаз в случаях неоднозначного положения точек расщепления ДНК. Был разработан метод определения сайтов звездной активности на примере эндонуклеазы ВхйК I. При изучении свойств этого фермента было обнаружено, что при определенных условиях он способен узнавать на ДНК дополнительные помимо собственного сайты, т. Предлагаемый нами метод позволил определить, что при незначительном отклонении условий инкубации от оптимальных эндонуклеаза иК I начинает узнавать сайты, которые содержат вырожденные нуклеотиды по краям сайга узнавания, а именно 5РиОЛТСС3 и 5СКЗАТСРуЗ В отдельных случаях вырождение сайта узнавания шло более глубоко, т. ШАТСС3 и 5ЮАТСЫЗ. Предлагаемый метод может быть успешно применен для детального исследования явления звездной активности для любых сайтспецифнческих эндонуклеаз. Явление модифнкациирсстршарш было открыто в ходе работ Бертранн и Вейгла в году, в которых было показано, что фаг X, размноженный на ипамме Е. Б С, претерпевает ограничение, т. К. Однако после одного цикла размножения на штамме Е. Ь К модифицируется таким образом, что при повторном посеве на ппаммы . С и . К размножается одинаково хорошо. После повторного размножения на пггаммс . С, он эту модификацию утрачивает и снова ограничивается на штамме . К . Данное явление получило название копролируемая хозяином модификация или явлен модификациирестрикции vii , 2, 3. Впоследствии, В. Арбером с сотрудниками в году было показано, что это явление обусловлено наличием в клетке пары фермешов слйтспецифи ческой эндонуклеазы, которая узнат характерные для неб последовательности на молекуле ДНК и расщепляет ев определн сим образом, и сйгспсцифичсской мети лазы, которая узнат те же последовательности на ДНК и модифицирует их, мстнлфуя основания А или С в опресе. Донором мстильных групп в клетке служит адснозилмстноннн. В отдельных случаях сайтспецнфическая эндонуклеаза и мстлаза представляют собой единый ферментный комплекс 2, 4. ДНК , 5, 6. Несмотря на то, что к настоящему времени открыто более продуцентов систем модификациирестрикции из более чем 0 штаммов микроорганизмов, подвергнутых анализу на предмет наличия сайтспецифических эндонуклеаз и метилаз, повидимому, системы модификациирестрикции присутствуют практически в каждом штамме 7. Трудности в их обнаружен, прежде всего, связаны с тем, по присутствие сайтспецифичсской эндонуклеазы может маскироваться присутствием сильной нуклеазной активности в лизате отсутствием сайта рестрикции на ДНК, используемой в качестве субстрата при скрипите слабой экспрессией фермента в клетке, его неустойчивостью к внешним воздействиям, либо потребностью в необычных кофакторах. Кроме того, системы модификациирестрикции сейчас детектируются в основном не по ограничению роста бактериофагов на пггамиах, а непосредственным скринингом коллекции на присутствие сайтспсцифичсских эндонуклеаз, так как для отдельных штаммов микроорганизмов бактериофаги до сих пор не выделены. Эго связано также с чисто практической целью. При скрининге детектируются в основном ферменты второго класса, наиболее часто используемые в генной инженерии, и нахождение подобных ферментов с новой специфичностью открывает потенциально новые возможности в создании новых генноинженерных конструкций. Системы модификациирестрикции к настоящему времени обнаружены пока только в одноклеточных микроорганизмах.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.185, запросов: 145