Структурно-функциональное исследование каталитического антиидиотипического антитела к ацетилхолинэстеразе эритроцитов человека

Структурно-функциональное исследование каталитического антиидиотипического антитела к ацетилхолинэстеразе эритроцитов человека

Автор: Александрова, Елена Сергеевна

Год защиты: 2001

Место защиты: Москва

Количество страниц: 108 с.

Артикул: 319704

Автор: Александрова, Елена Сергеевна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Стоимость: 250 руб.

Введение 6 Обзор литерату ры
1 Искусственные каталитические антитела
1.1 Каталитические антитела, полученные иммунизацией аналогами переходных состояний
1.2 Использование антител, содержащих кофакторы в связывающем центре
1.3 Ввод каталитичесой группы в связывающий центр антитела методом химической модификации или сайт направленного мутагенеза
1.4 Создание антител для катализа энергетически невыгодных превращений
2. Природные каталитические антитела
3. Антиидиотипнческие антитела
3.1 Антиидиотипнческие антитела к рецепторам
3.2 Антиидиотипнческие вакцины
3.3 Структурные исследования антиидиотипических антител
3.4 Каталитические антиидиотипнческие антитела
3.4.1 Антиндиотнпическое антитело 9С4Н9, обладающее рлактамазной активностью
3.4.2 Антиидиотипическое антитело 9А8, облачающее ацетилхолинэстеразной активностью
3.4.2.1. Строение активного центра и свойства ацетилхолинэстеразы
3.4.2.2 Идиотиническое антитело АЕ2
3.4.2.3 Антиидиотипическое антитело 9А8
4. Строение активных центров эстеролитических антител
4.1 Эстеролитическос антитело Е8
4.2 Эстеролитическое антитело СЖ6 и сравнение его с эстеролитическим антителом Е8
4.3 Сравнение активных центров трех эстеролитических антител, полученных на один аналог переходного состояния реакции
Результаты и нх обсуждение
1. Разработка методики выделения антител, проявляющих ацетилхолинэстеразную активность
2. Исследование взаимодействия идиотнпантиидиотин
3. Клонирование, определение первичной структуры и функциональная экспрессия фрагмснта антитела 9А8
3.1 Клонирование и определение первичной структуры антиидио гипичсского антитела 9А8
3.2 Функциональная экспрессия фрагмснта антитела 9А8
4. Идентификация каталитически активных аминокислотных остатков и моделирование активного центра антитела 9А8
4.1 Сравнительный анализ первичной структуры антитела 9А8
4.2 Взаимодействие антитела 9А8 с фосфонатными ингибиторами эстсраз
4.3 Массспектрометрический анализ пептидных фрагментов антитела 9А8
4.4 Моделирование активного центра антитела 9А8 Материалы и методы
1 Материалы
2 Методы
2.1 Наработка моноклональных антител
2.2 Гельфильтрация
2.3 Ионообменная хроматография
2.4 Аффинная хроматография
2.5 Денатурирующий электрофорез в ПААГ
2.6 Иммуноблоттинг
2.7 Исследование взаимодействия идиотипантиидиотип методом поверхностного плазмонного резонанса
2.8 Экспрессия фрагмента в . i
2.9 Выделение экспрессируемых фрагментов методом металлхелатной хроматографии
2. Амплнфицированный ферментзависимый иммуносорбционный анализ
2. Определение каталитической активности методом Эллмана
2. Подготовка белков к гидролизу
2. Триптический гидролиз белка для массспектрометрического анализа
2. Приготовление образцов для массспектрометрического анализа
2. Массспсктрометрический анализ методом МАЬЭ1
2. Взаимодействие антитела 9А8 со специфическими фосфонатными ингибиторами сериновых гидролаз
2. Выделение модифицированного пептида методом аффинной вытеснительной хроматографии
Выводы
Список литературы


Экспрессия фрагмента в . Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем являются каталитическими и происходят при участии высокоспецифичных и эффективных молекул ферментов. В последние годы с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененными свойствами. На этом поиск новых биокатализаторов не прекратился. В ряду каталитически активных молекул особое место занимают рибозимы каталитические РНК, и абзимы каталитические антитела. Антитела представляют собой белковые молекулы, способные взаимодействовать с высокой специфичностью практически со всеми природными или синтетическими антигенами. Количество последних, в отличие от ферментов, практически не лимитировано. В году Л. Полинг 1 предположил, что принципиальное различие между антителами и ферментами заключается в том, что первые наиболее специфично взаимодействуют с антигеном в его стабильной конформации низкоэнергетическом состоянии. Наоборот, ферменты проявляют максимальную специфичность к высокоэнергетическому переходному состоянию реакции. Таким образом, антитела, узнающие переходное состояние реакции могут проявлять каталитическую активность. В году Дженкс предложил использовать стабильные аналоги переходных состояний реакций в качестве иммуногенов для получения каталитических антител 2. Новая эра в этом направлении была открыта с введением в иммунологическую практику техники получения моноклональных антител 3. Количество реакций, катализируемых антителами, равно как и методик их получения, неуклонно растет. Современная абзимология включает в себя синтез новых аналогов переходных состоянии, введение кофакторов и каталитических групп в уже существующие антитела, сайтнаправлснный мутагенез. Большинство известных каталитических антител было получено данными методами, однако, развивается и альтернативный подход. Он опирается на свойства имунной системы образовывать антитела внутреннего образа и на идиотипическую гипотезу, высказанную в году Н. Ерни 4. Первым удачным примером каталитического антитела, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, созданное на активный центр ацетилхолинэсгеразы и проявляющее функции исходного антигена, то есть обладающее анетилхолинэстеразной активностью 5. Детальное изучение действия каталитического антитела, как и любого фермента, невозможно без определения его структуры и механизма действия, что и являлось целыо данной работы. Сравнение структуры активных центров исследуемого антитела и изученных эстсролитических антител полученных на аналог переходного состояния реакции будет способствовать лучшему пониманию причин возникновения и эволюции катализа альтернативными биокатапизаторами антителами. Функции антител в организме заключаются в узнавании чужеродных молекул. Связывая их, антитела инициируют каскад иммунного ответа, приводящий к элиминации антигена. Ферменты, активно связывающиеся с субстратом, катализируют их превращения в продукты реакции. Важным различием между антителами и ферментами является то, что специфичность последних закреплена генетически, следствием чего является их ограниченное количество, в то время как специфичность антител вытекает из особенностей молекул. При сопоставлении вышеприведенных фактов возникла идея соединить в одной молекуле каталитические возможности ферментов с возможностями специфического узнавания антигенов антителами. Эту концепцию каталитических антител впервые высказал Лайнус Полинг в году 1. Фиксация переходных состояний каталитических реакций антителами понижает, как и в случае ферментов, энергию активации. Из этого вытекает то, что антитела, специфически взаимодействующие с переходными состояниями реакций, скорее будут обладать ферментативными свойствами, чем антитела, антигенами которых являются субстраты реакций.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.184, запросов: 145