Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза

Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза

Автор: Болдырев, Александр Николаевич

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Кольцово

Количество страниц: 194 с. ил.

Артикул: 4561507

Автор: Болдырев, Александр Николаевич

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Диагностика туберкулеза.
1.1.1. Микроскопическая и культуральная диагностика
1.1.2. Туберкулинодиагностика
1.1.3. Современные иммунологические методы диагностики туберкулза.
1.2. Поиск иммупогенных белков для диагностики туберкулза.
1.2.1. Поиск иммуногенов среди белков М. i
1.2.2. Поиск иммуногенов с помощью экснрессионных библиотек геномов микобактерий туберкулзного комплекса
1.2.3. Источник иммуногенов области делений при сравнительном анализе геномов микобактерий туберкулзного комплекса и вакцинного штамма М. vi
1.2.4. Источник иммуногенов траиспозонные библиотеки интактиых патогенных микобактерий генетически изменнные микобактерии туберкулзного комплекса
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред, реактивы, реагенты и прочие материалы.
2.1.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред и питательные среды
2.1.2. Реактивы, реагенты
2.1.3. Ферменты
2.1.4. Бактериальные штаммы Е. i
2.1.5. Плазмиды
2.1.6. Олигодсзоксирибонуклсотиды
2.1.7. Клинические изоляты культур клеток М. i
2.1.8. Образцы сывороток, крови и мокрот.
2.1.9. Концентрированные буферы растворы
2.1 Рабочие буферы растворы.
2.1 Тестсистемы и наборы реактивовреагентов
2.2. Методы
2.2.1. Выделение ДИК.
2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.3. Полимеразная цепная реакция.
2.2.4. Лигазиая реакция
2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. i.
2.2.6. Поиск рекомбинантных клонов.
2.2.7. Наработка, выделение рекомбинантных плазмидных ДНК и трансформация штамма Е. i
2.2.8. Получение индуцированных культур штамма Е. i , содержащего рекомбинантные плазмиды, и поиск клонов, продуцирующих рекомбинантный белок
2.2.9. Отбор клонов, продуцирующих рекомбинантный белок
2.2 Электрофорез.
2.2 Иммуноблотинг белков.
2.2 Секвенированис клонированной нуклеотидной последовательности.
2.2 Наработка и выделение рекомбинантных белков
2.2 ИммунофермеитныЙ анализ
2.2 уИФНанализ
2.2 Биочипгибридизационный метод.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выбор видоспецифичных антигенов М. i для тестирования в ИФА и уИФНанализе.
3.2. Выбор экспрессирующего вектора для конструирования рекомбинантной молекулы, несущей ген, кодирующий аминокислотную последовательность целевого белка
3.3. Информационный поиск генов x, x и и дизайн праймеров для синтеза ампликонов, включающих эти гены.
3.4. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие видоспецифичные белки М. i.
3.5. Оптимизация условий для наработки рекомбинантных белков
3.6. Подбор условий для выделения и очистки рекомбинантных белков.
3.7. Испы тание рекомбинантных видоспецифичных белков М. i в ИФА, уИФ
анализе на клинических изолятах крови.
3.7.1. Рекомбинантные белки в иммуноферментном анализе
3.7.2. Рекомбинантные белки в уИФНаиализс.
3.8. Анализ изолятов мокроты с помощью ПЦР и биочипгибридизационного метода
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ х , 2х , Зх и т.д. кратность буферасреды или число повторяемых операций ЛсК ацетат уксуснокислый калия натрия
Ар ампициллин
вакцина БЦЖ i i
ВСР бромхлориндолилфосфат, динатриевая соль
бромистый этидий
глюкоза
i глутамин
глицин
глутатионтрансфераза i
глутатионтрансферазацелевой белок
I индикаторные пробирки для роста микобактерий i ii
МНС главный комплекс гистосовместимости iiii x
нитротетразолия хлорид голубой фснилмстилсульфонилфторид
очищенный белковый дериват ii i iviv
область различия i i
ТАЕ трисацетатный буфер 7яро1 7яполимераза трисглициновый буфер
буфер для трансформации и хранения компетентных клеток уИФН гаммаинтерферон
уИФНанализ уинтерфероновый гаммаинтерфероновый анализ уИФНЕЬБроанализ гаммаинтерферонспотанализ
а.о. аминокислотный остаток ац. ацетон АА акрилам ил
АП аминокислотная последовательность
АГК антигенпрезентирующая клетка
БКГ буфер для концентрирующего геля
БНП буфер для нанесения проб ДНК
БГ1Б буфер для переноса белков
БРГ буфер для разделяющего геля
БСА бычий сывороточный альбумин
БФС бромфеноловый синий
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ДМСО диметил сульфоксид
дНТФ дезоксирибонуклеозидтрифосфат
ДСН додецилсульфат натрия
ДСНПААГ ДСНПААгель полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия
ДТТ дитиогреит
НАС изоамиловый спирт
ИБ инкубационный буфер
ИГС изопропиловый спирт изопропанол
ИПТГ изопропилтиогалактопиранозид
ИФА иммуноферментный анализ
ИФлА иммунофлуоресцентный анализ
к.т. комнатная температура
КАПХ конъюгат авидиниероксидазы хрена
КБА уИФН конъюгат бйотинилированных антител к гаммаинтерферону
КонА конканавалин А
КРС крупный рогатый скот
КФ культуральный фильтрат
КЦ ксилолдианол
ЛизБ лизирующий буфер
м.м. молекулярная масса
МБ маркры молекулярных масс белков
МБАА метиленбисакриламид
МВТ микобактерии туберкулза
МКА моноклональноеые антителоа
МКА уИФН моноклональные антитела к гаммаинтсрферону МКА моноклональные антитела к глутатионтрансферазе МКГ1К мононуклеарные клетки периферической крови МЛУ множественная лекарственная устойчивость
МТК микобактерии туберкулзного комплекса, или микобактериальный
туберкулзный комплекс
МФ маркры длины ДНКфрагментов
МЭ меркаптоэтанол
НК ночная культура
НМ нуклеотидный материал
НП нуклеотидная последовательность
НЦ нитроцеллюлозныйая
ОП оптическая плотность ОРС открытая рамка считывания п.н. пара нуклеотидов ГА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция ПЭГ полиэтиленгликоль РНК аза рибонуклеаза А.
СМЖ спинномозговая жидкость
Т твин
Т X0 тритон X
ТВП температурновременной профиль
ТЕМЕД тетраметилэтилендиамин
ТМБ тетраметилбензидин
трис трисгидроксимстиламинометан
УЗД ультразвуковой дезинтеграт, или соникат
УК уксусная кислота
ФБ фосфатный буфер
ФБС фосфатный буфер, солевой
ФБСТ фосфатный буфер, солевой, с твином
ФБЦ2К фосфатный буфер, щелочной, с 2 красителями
ФГА фитогемагглютинин
хлф. хлороформ
ЦТАБ цетилтриметиламмоний бромид ЭБ элюирующий буфер ЭР эндонуклеаза рестрикции, рестриктаза ЭФ электрофорез
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Работа выполнена автором самостоятельно при участии коллег ГНЦ ВБ Вектор, которое сводилось к отдельным методическим моментам и обсуждению полученных результатов. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками отдела иммунотсрапевтических препаратов ГНЦ ВБ Вектор к. Ю.В. Тумановым, к. ОЛО. Смирновой, к. О.В. Носаревой, к. АЛО. Сивковым, к. М.Ш. Азаевым и д. С.И. Татьковым. Автор им искрение благодарен. Центра, которые способствовали продвижению и завершению этого исследования н. Горбунова Ю. А., Азаеву Ф. З. ЗАО ВекторБест, н. Боднева С. А., к. Шустова , к. Тернового В. А., к. Сафатова , Буряк Г. А. и в особенности своих рецензентов, бескорыстный труд которых всегда почемуто остатся в тени, д. Тикунову Нину Викторовну и к. Протопопову Елену Викторовну. В качестве диагностического материала чаще всего используют мокроту больного, мочу или различные тканевые жидкости, в число которых в первую очередь входит кровь, содержимое желудка, взятое в утренние часы, а также мазки культуры или тканевые срезы для микроскопирования. В общем, взятие диагностического материала в значительной степени зависит от локализации инфекционного процесса. При наличии микобактерий в мазке положительный результат культивирования наблюдается в случаев. Если же туберкулзный процесс выражен в незначительной степени, то в случаев результаты микроскопирования оказываются ложноотрицательными даже при многократном повторении с интервалом в несколько дней. Параллельно каждый раз производится и посев предполагаемых микобактерий. В этом случае прибегают к другим методам исследования, например, использованию в качестве клинического материала бронхоальвсолярного лаважа бронхоскопия. Как правило, после получения положительного результата в мазке или при высеве культуры М. Культуральное исследование мокроты дополняет и подтверждает данные, полученные при микроскопировании, однако является весьма длительным процессом. Разработанные радиометрическая ВЛСТЕС ТВ и Iсистемы, использующие высокоселективные жидкие среды, позволяют снизить временные затраты на культивирование до 4 и дней соответственно i . Они также могут быть использованы для определения устойчивости М. Исследованные в этой работе изолятов с известным заранее смешанным фенотипом лекарственной устойчивости показали наджность обеих систем противоречивые результаты получены только в одном случае. Однако сравнительные исследования систем ВАСТЕС 0, I и культивирования на среде Левенштейна Йенсена, проведнные на большем числе клинических изолятов, показали меньшую чувствительность ,8, ,4 и ,9 соответственно со средней продолжительностью культивирования кислотоустойчивых микобактерий 8 и дней для первых двух систем. ВАСТЕС I 0, которая не требовала добавления в питательную среду радиоактивной Спальмитиновой кислоты i Е. Эта система, хотя и уступала по некоторым показателям ВАСТЕС 0, в то время была признана лучшей. Среднее время возрасло до дней максимальное до 1 мес. Колебания продолжительности и чувствительности определения зависели от многих факторов состава добавляемых в среду противомикробных препаратов для снижения контаминации, вызываемой, например микобактериями, не относящимися к МТК, микроорганизмов грибкового происхождения и варьирования состава используемых сред для культивирования. Несмотря на достигнутые успехи, связанные с разработкой систем по сокращению времени культивирования патогенных микобактерий, относительно недавно повторно было показано, что медленно растущие микобактерии способны расти на кровяном агаре, причм колонии можно было выявлять уже спустя недели М. Колонии М. Ранее это открытие, как описывают авторы статьи, было сделано Р. Кохом, которому впервые удалось выделить М. Позднее было показано, что по эффективности выявляемости микобактерий кровяной агар превосходит среду, используемую в системе ВАСТЕС М. В последние годы разлиуные системы выявления микобактерий туберкулза, основанные на культивировании их в жидкой среде, продолжали совершенствоваться . С. . Одним из перспективных направлений является их объединение с другими методами обнаружения микобактерий i . V М. V М.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.201, запросов: 145