Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов

Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов

Автор: Семенова, Елена Александровна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2004

Место защиты: Кольцово

Количество страниц: 118 с. ил.

Артикул: 2623352

Автор: Семенова, Елена Александровна

Стоимость: 250 руб.

Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов  Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов 

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ретровирусная интеграция
1.1.1. Реакция интеграции в жизненном цикле ретровирусов
1.1.2. Структура ретровирусной интегразы
1.1.2.1. ННССдомен интегразы ретровирусов
1.1.2.2. Каталитический домен интегразы ретровирусов
1.1.2.3. Сконцевой домен интегразы ретровирусов
1.1.3. Мультимеризация ретровирусной интегразы
1.1.4. Механизм расщепления ДНК и реакции присоединения
1.1.5. Ферментативные свойства ретровирусной интегразы
1.1.6. Последовательности, узнаваемые ретровирусной интсгразой
1.1.7. Проникновение прсинтеграционного комплекса в клеточное ядро
1.2. Методы измерения активности ретровирусной интегразы ш vi
1.3. Ингибирование интегразы ВИЧ1
1.3.1. Подходы к ингибированию репликации ВИЧ1
1.3.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Соединения для тестирования ингибирующей активности в отношении рекомбинантной интегразы ВИЧ
2.1.2. Буферы, используемые в работе
2.1.3. Олиголсзоксирибонуклеотиды
2.2. Методы
2.2.1. Выделение ДНК ВИЧ1
2.2.2. Полимеразная цепная реакция
2.2.3. Клонирование интегразы ВИЧ1
2.2.4. Выделение и очистка рекомбинантной интегразы
2.2.5. Конструирование субстратов для определения активности рекомбинантной интегразы ВИЧ1 т уИго
2.2.5.1. Конструирование олигонуклеотидного субстрата
2.2.5.2. Конструирование ЬТЯсодержащих субстратов
2.2.6. Определение ферментативной активности интегразы
2.2.6.1. Определение ферментативной активности интегразы в реакции 3процессинга
2.2.6.1.1. Ингибитороный анализ реакции Зпроиессинга, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ1Вт
2.2.6.2. Определение ферментативной активности интегразы в реакции 3встраивания
2.2.6.2.1. Определение ферментативной активности интегразы в реакции Звстраивания с использованием плазмидной ДНК рис в качестве ДНК мишени
2.2.6.2Л. Определение ферментативной активности интегразы
в реакции Звстраивания с использованием ЬТЯсодержашего субстрата в качестве ДНК мишени
2.2.7. Ингибиторный анализ репликации ВИЧ1 в культуре лимфоидных клеток МТ
2.2.8. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВПЧ1Вги
3.1.1. Получение рекомбинантной интегразы ВИЧ
3.1.2. Сравнение нуклеотидной последовательности рекомбинантной интегразы Вт ВИЧ1 с интегразой
3.1.3. Измерение каталитических характеристик рекомбинантной интегразы ВИЧ1Вгн в реакции 3процессинга
3.1.4. Взаимодействие рекомбинантной интегразы ВИЧ1 с двухвалентными ионами металлов
3.2. ИНГИБИРОВАНИЕ РЕАКЦИИ ЗПРОЦЕССИИГА, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗОЙ В И Ч
3.2.1. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ1 производными тритерпеновых соединений
3.2.2. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ1 производными полицикланов
3.3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОТЯЖЕННЫХ ДНК СУБСТРАТОВ НА ОСНОВЕ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ
3.3.1. Конструирование содсржаших ДНК субстратов
3.3.2. Использование сконструированных субстратов для определения активности рекомбинантной интегразы ВИЧ i vi
3.3.3. Анализ активности рекомбинантной интегразы ВИЧ1 с использованием содержащих ДНК субстратов и олигонуклеотидного дуплекса в реакции Зпроцсссинга
3.3.3.1. Исследование влияния ионов Мп2 и 2 на функциональную активность интегразы с использованием разнь типов субстратов
3.3.3.2. Исследование ингибирующей активности ауринтрикарбоновой кислоты и производных тритерпенов в отношении интегразы ВИЧ с использованием содержащих
субстратов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Синдром приобретенного иммунодефицита СПИД является болезнью иммунной системы, которая сопровождается развитием у больных глубокой иммунной недостаточности, проявляющейся в том, что безопасные для здорового человека микроорганизмы приобретают способность вызывать тяжелые инфекционные заболевания оппортунистические инфекции. Причиной возникновения СПИДа является вирус иммунодефицита человека ВИЧ, относящийся к семейству Ретровирусов i Л. Е.О. Актуальность и практическая значимость поиска новых противовирусных средств для антиВИЧ терапии особенно подчеркивается в настоящее время, когда в России, и, в частности, в Сибирском регионе, отмечается нарастание темпов распространения ВИЧ инфекции по данным . В настоящее время при лечении ВИЧинфекции используются ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ, основным недостатком которых является 1 изза гомологии вирусной протеазы с эукариотическими протеазами и, соответственно, обратной транскриптазы с ДНКполимеразами клетки, препараты на основе этих ингибиторов являются токсичными для человека. ВИЧ характеризуется низкой точностью синтеза ДНК по сравнению с другими ДНКполимеразами. Это определяет высокую частоту мутаций во время репликативного цикла вируса, что в свою очередь приводит к появлению лекарственно устойчивых форм вируса во время длительного лечения пациентов . ДНК, которой будет достаточно для дальнейшей экспрессии вирусного РНКгенома и вирусных белков. Наиболее перспективной мишеныо для создания новых антиретровирусных препаратов считается третий вирусный фермент интеграза, осуществляющая интеграцию провирусной ДНК в геном клеткихозяина и отличающаяся своей мультифункциональностыо от клеточных ферментов Е. М. , . Интеграция происходит в несколько стадий, в результате которых происходит встраивание вирусного генома в ДНК хозяйской клетки. Первоначально в реакции Зпроцессинга линейная ДНК провируса, синтезированная в реакции обратной транкрипции, гидролизуется интегразой с каждого ЗОН конца i длинные концевые повторы по консервативному САдинуклсотиду, при этом удаляется дннуклеотид. Следующая стадия интеграции происходит в ядре и включает в себя образование интегразой одноцепочечных разрывов в хозяйской ДНК и лигирование с проиессированными ЗОИ концами провирусной ДНК i . Предположительно, ингибиторами интегразы могут быть как конкурентные, так и неконкурентные ингибиторы, которые будут нарушать мультимернзацию интегразы, необходимую для функционирования фермента, механизм транспорта преинтеграционного комплекса в ядро, стадию процессинга и встраивания провирусной ДНК в геном клеткихозяина. На сегодняшний день были найдены несколько групп соединений, обладающих способностью подавлять активность рекомбинатной интегразы i vi и репликацию ВИЧI в культуре клеток. Это выявленные в результате скрининга производные дикетоновой кислоты, производные нуклеотидов, ароматические соединения с гидроксильными группами и т.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.197, запросов: 145