Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей

Роль белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей

Автор: Брандина, Ирина Львовна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2005

Место защиты: Москва

Количество страниц: 197 с. ил.

Артикул: 2801396

Автор: Брандина, Ирина Львовна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Импорт тРНК в митохондрии
1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших
1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии .
1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид
1.1.2.а. Отряд ii.
1.1.2.6. Отряд ii
1.1.3. Другие представители простейших.
1. 2. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей
1.3. Импорт тРПК в митохондрии растений
1.4. Импорт тРНК в митохондрии животных
2. Убиквитинпротеасомная система деградации белков
2.1.Введени е
2.2. Функции УПС в клетке
2.3. Убиквитииилирующая система в . vii
2.4. протсасома строение и функционирование.
2.4.1. субчастица, или каталитическое ядро
2.4.2. регуляторная субчастица
2.5.Гдс локализованы протеасомы в клетке
2.6. Узнавание полнубиквитиновых цепей
2.6 Протеасомиые субъединицы, узнающие полиубиквитиновые цепи.
2.6.2. ЕЗ и Е4 ферменты в направлении субстратов к протеасоме
2.6.3. Доставка субстратов к протеасоме посредством Сс1с и его кофакторовАЪ
2.6.4. Шапероны и их кофакторы в деградации белков.
2.7. путь
. 1 как компонент .
2.8. Непротсолитическая роль убнквитина и убиквитинсвязывающнх белков в клетке .
2.8.1. Образование моноубиквитинилировапных белков.
2.8.2. Связывание моноубиквитинилировапных белков с различными убиквитинсвязывающими доменами
2.8.3. Альтернативные функции убиквитииа.
. Убиквитин изменяет локализацию белков.
Б. Убиквитин влияет на функцию белков
. Убиквитин регулирует белокбелковые взаимодействия
Г. Убиквитин влияет на наследование и морфологию митохондрий.
Д. Убиквитин участвует в митохондриальной локализации белков.
2.9. Индукция УПС и каскадов протеннкиназ в ответ на тепловой шок
3. Енолаза тли колитический фермент.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы
Реактивы.
Коммерческие наборы
Антитела.
Приборы и оборудование
1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток.
1.1. Штаммы ii i
1.2. Штаммы vii
1.3. Линия клеток человека
2. Условия выращивания организмов.
Дрожжевые питательные среды.
3. Генноннженерные конструкции.
4. Г енноинженерные методы.
4.1. Полимеразная ценная реакция ПЦР
4.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование
4.3. Лигирование
4.4. Обратная транскрипция и амплификация.
5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгсра
6. Трансформация клеток .i
7. Трансформация vii плазмидной ДНК
8. Трансформация vii библиотекой кДНК
9. Определение фенотипов штаммов дрожжей . vii
. Исключение плазмиды, содержащей маркер 3 из дрожжевых клеток
. Определение активности галактозидазы
.1. Определение активности галактозидазы с помощью иммобилизации клеток на нитроцеллюлозных фильтрах
.2. Определение активности галактозндазы с использованием раствора X в
0.5 агаре
. Скрещивание дрожжей.
. Выделение ДНК из клеток дрожжей.
. Выделение митохондриальных РНК из дрожжей.
.1.Выделение митохондрий.
.2. Выделение митохондриальных РНК.
. Выделение суммарных клеточных РНК из дрожжей
. Г нбридизацня по I Гозерну
. гибридизация
. Мечение тР1 I для реакций импорта
. Проверка ахоацнлировання РНК методом перйодатного окисления и мечения с
использованием РНКлигазы.
. Транспорт радиоактивно меченной ТРК1 в изолированные митохондрии
.1. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.
.2. Выделение митохондрий из клеток дрожжей
.3. Исследование импорта РНК в изолированные митохондрии
. Выделение митохондрий из клеток человека
. Выделение митохондрий из гепатоцитов быка.
. Измерение активности протеасомы i vi
. Локализация митохондриальных белков.
.1. Получение 8меченных белков.
.2. Импорт 8меченных белков в изолированные митохондрии дрожжей
. Локализация 8меченых снолаз в митохондриальной фракции дрожжей.
. Конфокальная микроскопия клеток дрожжей.
. Определение энзиматической активности гликолитических ферментов.
. Выделение фракции, обогащенной внешними мембранами митохондрий дрожжей
. Двумерный нативный электрофорез по Шагеру и фон Ягову.
.4. гибридизация .
. Иммунопреципитация.
. Методы массспектрометрического анализа
.1. Визуализация белков в ПААГ.
.2. Расщепление белков трипсином в геле
.3. I ТОР анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поиск потенциальных факторов импорта тРНК с использованием дву и тригибридных систем в дрожжах
1.1. Поиск белков, взаимодействующих с в двугнбрндной системе
1.1.1. Метод двугибридной системы в дрожжах
1.1.2. Скрининг библиотек кДНК для поиска белков, связывающих . .
1.2. Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК.
1.3. Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта
1.3.1. Роль убнквитиппротсасомной системы в импорте тРНК
. Возможная роль субъединицы протеасомы 3 в импорте тРНК
Б. как фактор импорта и компонент пути
. Влияние остановки каталитической функции УПС на эффективность импорта ТРК1 в митохондрии дрожжей
В.1. Анализ давня импорта тРНК в митохондрии штаммов, дефектных по
каталитической функции протеасомы.
В.2. Использование ингибитора протеасомы и цистеииовых протеиназ 2.
1.3.2. Анализ роли других потенциальных факторов импорта
. Регулятор транскрипции
Б. Ингибитор протеинкиназ I1.
. Белки, специфически связывавшиеся с ТРК1 в тригибрндной системе, 1 и
Г. Транспортер магния
Д. РНКзависимые хелнказы 1 и 1.
2. Новые функции енолазы как фактора импорта тРНК.
2.1. Анализ локазизации енолазы в клетках дрожжей i viv с использованием гибридизации
2.2. Локализация Епо2р, меченной , в клетках дрожжей.
2.3. Енолаза, связанная с митохондриями, является функционально активной.
3. Анализ митохондриальных комплексов, содержащих енолазу
. Использование двумерного нативного электрофореза.
Б. Использование иммунопреципитации с антителами к енолазе
. Сравнение и анализ результатов, полученных двумя методами
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Анализ активности гликолитических ферментов в дрожжах, клетках человека и
печени быка.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


С использованием системы импорта тРНК в изолированные митохондрии было показано, что только такой дицистронный транскрипт проникает в митохондрии Т. РНК не импортируются v и , . Болес того, мутации внутри фрагмента приводили к изменениям локализации различных эндогенных тРНК. Эти данные указывают непосредственно на влияние iдействия фланкирующей последовательности на эффективность импорта тРНК в виде предшественника у трипаносом. Возможно, причина данных противоречий заключается в том, что разные группы исследователей используют разные линии трипаносом, а получаемые результаты во многом зависят от способа выделения митохондрии. Отряд ii. В отличие от трипаносом, у лейшмаиий, в частности у . I, тогда как II частично проникает в митохондрии . Причем сигнал импорта содержится в самой структуре тРНК i и i, . При сравнении последовательности нуклеотидов частично импортируемой , с нуклеотидной последовательностью неимпортируемой , была выявлена единичная замена С на в петлс и несколько замен в других участках молекулы i . По всей видимости, специфическая детерминанта импорта локализована именно в нетлс, поскольку замена встви i на соответствующий участок эффективно импортирующейся 1I придаст , способность проникать в митохондрии. Другая группа исследователей показала, что консервативный мотив в петле тРНКТугС1Ю Рис. РНК i vi . Рис. Структурная гомология пстсль трех тРК ii. Консервативные мотивы выделены. Анализ распределения импортируемой тРНКТут в митохондриях показал, что импорт происходит в несколько стадий, причем кинетика транспорта через внутреннюю и внешнюю мембраны различается i . Транспорт через внешнюю мембрану это АТФзависимый процесс, а транспорт через внутреннюю мембрану зависит как от химического, так и от электрического потенциала на мембране. На основании полученных данных была высказана гипотеза о существовании различных рецепторов на внешней и внутренней митохондриальных мембранах Рис. Рис. Гипотетическая схема импорта тРНК через две митохондриальные мембраны лейшмавий. РНК. I рецепторный комплекс внутренней мембраны. Импортируемая тРНК взаимодействует с белковым рецептором на внешней митохондриальной мембране и , . Этот белок был выделен и охарактеризован как кДа РНКсвязывающий белок от англ. При помощи антител к белку было показано, что он взаимодействует с импортируемой тРНКТуг, но не взаимодействует с тРНКп, которая локализована исключительно в цитоплазме . Таким образом, взаимодействие тРНК с ГАВ определяет специфичность импорта. Эксперименты по импорту тРНКг в фосфолипидные везикулы показали, что ее связывание с рецептором приводит к гидролизу АТФ внутри везикул с последующей генерацией мембранного потенциала при участии i АТФазы и открыванию каналов импорта и , . I от англ. Этот мультисубъединичный белковый комплекс, около 0 кДа, был изолирован и направлял импорт тРНКТуг, равно как и искусственно синтезированных олигонуклеотидов, в фосфолипидные везикулы в присутствии АТФ и мембранного потенциала . Этот комплекс включает в себя два белка, размером и кДа, которые связывают различные тРНК тРНКТуг и тРНК1с, соответственно специфически и алл ос гери чески Рис. Рис. Модель взаимодействия импортируемых тРНК с рецепторами р и р белковою комплекса I, расположенными во внутренней митохондриальной мембране I. Образование комплекса Рср с тРНКт ингибируется в присутствии тРНК1с, в то время как комплекс ВсртРНКС активируется тирозоновой тРНК ВЬаиасЬагууа е а. Авторы предполагают модель функционирования комплекса по типу пингпонга Рис. Рецептор Вср связывается с тРНКуг, что приводит к формированию комплекса, способного осуществлять импорт этой тРНК. Далее комплекс тРНКугРср контактирует Кср, активируя его сайт связывания с тРНКс. После связывания тРНК1с с РС р, происходит второе конформационное изменение комплекса, в результате которого тРНКуг диссоциирует от Рср, происходит потеря контакта между двумя рецепторами Рс р и Рср, и затем к перенос тРНКс в канал импорта. Этот механизм может поддерживать равновесие между двумя типами импортируемых тРНК в митохондриальном матриксе, а также объяснить отсутствие конкуренции между ними за один и тот же канал импорта.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.730, запросов: 145