Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей

Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей

Автор: Калебина, Татьяна Сергеевна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2003

Место защиты: Москва

Количество страниц: 204 с. ил.

Артикул: 2616933

Автор: Калебина, Татьяна Сергеевна

Стоимость: 250 руб.

1 ВВЕДЕНИЕ 8 И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОСИНТЕЗА ЕЕ КОМПОНЕНТОВ
1.ГЛЮК АН
1.1. Строение и локализация глюкана в клеточной стенке
.Биосинтез ,3глюкана
1.3. Встраивание Щ,3глюкана в клеточную стенку
1.4. Биосинтез и встраивание р 1,6глюканов
2 ХИТИН
2.1. Локализация в клеточной стенке
2.2. Основные этапы биосинтеза хитина 2
3 БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И
РАЮОБРАЗИЕ
3.1. Экстракция белков из клеточной стенки
3.2 Оманнозилированые белки
3.3.Кманнозилированые белки
3.4 Белки, содержащие остаток гликозилфосфоинозитольного якоря
3.5. Основные этапы биосинтеза 1 и Освязанных маннозных цепей и ферменты, их осуществляющие
3.5.1.Биосинтез Огликозидных цепей
3 5 2. Биосинтез Ыгликозидных цепей
3 6. Разнообразие белков клеточной стенки дрожжей
3.6.1. Белки, экстрагируемые детергенами и тиоловыми реагентами при нагревании
3.6 2 Белки, экстрагируемые глюканазами
3.6.3. Белки, экстрагируемые щелочью
3.7. Регуляция экспрессии белков ковалентно связанных с глюканом клеточной стенки дрожжей
4 СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИДРОЖЖЕЙ И РОЛЬ БЕЛКОВ В ФОРМИРОВАНИИ И ПОДДЕРЖАНИИ ЕЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Используемые в работе реактивы
2. Используемые в работе штаммы микроорганизмов и условия их выращивания
3 Выделение ДНК
3.1 Выделение плазмидной Д1I
3.2. Выделение ДНК из дрожжей
3.3. Выделение ДНК из грибов
3 4 Выделение ДНК из бактерий и архебактерий
4. Выделение РНК из дрожжей
5. Электрофоретические методы
5.1. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
5.2 Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях
6. Методы клонирования
6 1. Ферментативная обработка ДНК
ф 6.2. Введение чужеродной ДНК в клетку . i
6.2.1. Трансдукция . i бактериофагом лямбда
6.2.2. Трансформация .i
6 2.3. Трансформация дрожжей
6.3. Создание геномной библиотеки i ii
6.4 Библиотека генов
7. Радиоактивное мечение плазмид и фрагментов ДНК никтрансляцией
8 Ссквенирование ДНК
9. Саузернблот гибридизация
Нозернблот гибридизация
. ПЦРамплификация
. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения
. Выделение клеточных стенок дрожжей
. Депротеинизация КС дрожжей с помощью трипсина и проназы, а также
Экстракция белков из КС дрожжей ., в нашей модификации
. Выделение и анализ белков среды роста дрожжей
1 Выделение белков из среды роста дрожжей
2 Анализ устойчивости белков среды роста к действию трипсина
. Получение внутриклеточною содержимою клеток дрожжей
. Получение антител к белку с молекулярной массой кДа
. Вестернблот анализ
Определение количества компонентов в изолированных КС дрожжей
.1 Определение количества белков в изолированных КС дрожжей
.2 Определение количественного содержания полисахаридов КС
.3 Определение содержания аминосахаров
Выделение и очистка белков
.1. Выделение клостридиолептидазы А
.1.1. Очистка клостридиопептидазы А на ДЕАЕцеллюлозе
.1.2 Очистка клостридиопептидазы А препаративным электрофорезом
.2. Хроматография культуральной жидкости i vi штамм 5.4 на
аффинных сорбентах бацитрацинаминосилохолм и фенилборонатсефароза
.3. Выделение белков с молекулярной массой 6 и ЗЗкДа из клеточной стенки
дрожжей i ii
.4. Выделение хитиназы из среды роста дрожжей
4.1 Получение коллоидного хитина
ф .4.2. Выделение хитиназы
. Определение активности ферментов
.1. Активность коллагеназ
.2. Общая протеолитическая активность
3. Маннозидазная и глюкозидазная активности
.4. Активность амннопептидаз
.5 Активности рглюканазы, хитиназы и инвертазы
6. Определение литической активности и обработка клеток и клеточных стенок
гидролазами
Определение количества белка
Определение числа клеток и клеточных стенок дрожжей
. Определение выхода инвертазы из клеток дрожжей
Определение чувствительности клеток дрожжей к ингибиторам роста
.1 Определение чувствительности клеток к i и
2 Определение чувствительности клеток дрожжей к Никомицину
Определение аминокислотного состава белка
Получение и анализ смеси пептидов
. Определение концевой последовательности аминокислот
Вестернблот анализ
. Микроскопические методы
.1. Электронная микроскопия клеток и КС дрожжей
.2. Окрашивание клеток дрожжей i ii примулином
.3. Окрашивания клеток дрожжей Калькофлюором Зональное центрифугирование клеток дрожжей IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Обнаружение в клеточной стенке дрожжей белков, выполняющих роль структурных элементов
1.1. Выделение сериновой протеиназы из культуральной жидкости i vi.
1.2. Изучение действия сериновой протеиназы из культуральной жидкости i vi на стенки и клетки дрожжей
1.3 . Обнаружение в кле очной стенке дрожжей белков, гидролиз которых приводит к деструкции клеточной стенки.
1.4 Идентификация и изучение роли белка с молекулярной массой 1 бкДа Р6 из клеточных стенок дрожжей i ii
1.5.Идентификация белка с молекулярной массой кДа РЗЗ как глюкантрансферазы ф
1 5.1 Выделение и характеристика РЗЗ
1.5.2 Оредсление поседовательности гена, кодирующего белок с молекулярной массой кДа из КС дрожжей i ii
2 Изучение роли глюкантрансферазы 2 в формировании молекулярной структуры КС дрожжей
2 1. Получение штамма дрожжей .vii, лишенного гена
2.2. Изучение культуральных свойств штамма с нарушенным геном
2.3. Сравнительный анализ количества хитина и других компонентов КС дрожжей 2 2 4 Анализ встраивания хитина в клеточные стенки дрожжей штамма
2.5. Выявление роли хитинсинггаз в биосинтезе дополнительного хитина в штамме
3. Изучение роли заякоренных белков во встраивании белков в КС дрожжей vii
4 Изучение роли Оманнозилированных белков в формировании молекулярного ансамбля
клегочной стенки дрожжей
4.1 Выбор объекта исследования
4 1.1. Сравнительный анализ структурной роли белков и полисахаридов в клеточных стенках дрожжей, и vii
4.2. Изучение роли Огликозилированных белков для формирования молекулярного ансамбля клеточной стенки
4.2.1. Получение штамма с делецией генаРМТ
4.2.2. Определение уровня Огликозилирования у штамма с нару шснным геном на примере хитиназы
4.2.3. Фенотипические проявления при нарушении гена РМТ1 у дрожжей
4.2.4. Сравнение состава клеточных стенок дрожжей исходного
1 штамма и I дизруптанта.
4.2.5. Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей исходного штамма и дизруптанта
4 2.6. Электронная микроскопия дрожжей с нарушенным геном
5. Исследование белков и геномных последовательностей дрожжей, содержащих элементы гомологии с альфа цепыо коллагена высших эукариот
5.1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках дрожжей i
i i с использованием клостридиопептидазы
5.2. Определение влияния коллагсназы на некоторые гидролазные
активиости,ассоциированные с клеточной стенкой дрожжей.
5.3 Идентификация геномных последовательностей микроорганизмов, гомологичных
кДНК спиральной части молекулы коллагена цыпленка
5.4 Изучение фрагмента геномной ДНК дрожжей i ii, гомологичного генам коллагена 1 типа
5 4.1.Клонирование фрагмента геномной ДНК С. ii, гомологичного кДНК спиральной части молекулы коллагена 1 типа
5 4.2. Анализ нуклеотидной последовательности
5.4.3. Выявление п.н коллагенового модуля в клонированной дрожжевой последовательности
V ЗАКЛЮЧИЛ ГИЕ
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Хитинсвязанные ,3глюканы играют, повидимому, основную роль в поддержании формы клетки и придают жесткость структуре КС Кореска . В толше клеточной стенки глюкан располагается между наружным и внутренним слоями маннопрогеинов и сам, в свою очередь, неоднороден в своем строении и составе. В следующем разделе обзора литературы мы рассмотрим основные этапы биосинтеза и встраивания глюкана дрожжей. Клетки дрожжей становятся нежизнеспособными при одновременной делении генов 1 и 2 I . Известно, что интенсивность биосинтеза глюкана в процессе клеточного цикла дрожжей меняется. В начале клеточного цикла она возрастает и достигает масимума к середине фазы, а затем, к моменту завершения образования стенки дочерней клетки, снижается. Эта картина отражает изменяющуюся в процессе цикла активность глюкансинтетазы Вагабов, Транскрипция 1 также регулируется клеточным циклом, она максимальна в поздней 1 фазе непосредственно перед появлением почки . Активность глюкансинтетазы регулируется ГГФазой 1р. I . Для активации необходимо взаимодействие этой субъединицы с ГТФсвязанной формой i . Встраивание . Глюкансинтетазный комплекс локализован в цитоплазма ической мембране таким образом, что синтезируемые 1,3 линейные цепи глюкана поступают в периплазматическое пространство и затем в клеточную стенку . В этом же участке клеточной поверхности в местах инвагинации мембранны i , . Если рассмотри вать молекулы и фибриллы 1,3 глюкана как жесткий наружный скелет клетки, то вполне логичным является его связь с формированием скелета внутриклеточного. Показано, что , необходим для поляризации актинового цитоскелета . В мутантах уменьшается глюкансинтетазная активность и наблюдаются дефекты в поляризации актина v . При встраивании в клеточную стенку линейные полимеры глюкана модифицируются. В модификации ,3глкжана непосредственно в момент синтеза молекулы или после его завершения . Эти ферменты локализованы в клеточной стенке и закреплены в ней нековалентно . XI, на который приходится около глкжаназной активности см. Ранее считалось, что основной эндоглюканазой клеточных стенок дрожжей является 2 , . В настоящее время исследователи полагают, что при высокой концентрации нередуцирующих концов глюкана как в случае КС 2 является гликозилтрансферазой . Vi, . I vi 2 переносит р1,3связанный глюкановую цепь, состоящую не менее чем из 5 мономеров, на нередуцирующий конец другй цепи ,3глюкана по меньшей мере из 4х глюкозных остатков, формируя между ними р 1,6связь . Возможно именно таким образом к уже существующим в КС глюкановым цепям присоединяются новые молекулы . Vi, К данной схеме мы будем обращаться в последующих разделах обзора литературы при изложени результатов, описывающих встраивание других полимеров в клеточную стенку дрожжей. Еще одним белком, вовлеченным в модификацию Я,3глюкана, является 1заякоренный белок плазматической мембраны Vi, . I vi этот белок катализирует гидролиз олигосахаридов ,3глюкана различной шины не мснсс мономеров и последующий перенос редуцирующего конца полученного фрагмента на нсредупирующий конец другой глюкановой цепи , , что приводит к его удлинению цепей ,3глюкана которые после элонгации могут служить акцепторами белков КС или ,6глюкановых цепей . Не только синтез глюкана но и его последующие модификации находятся под контролем клеточного цикла. Так например, от клеточного цикла зависит интенсивность транскрипции 1 и X1. Наибольшее количество мРНК этих белков обнаруживается в 1 фазе . Р1. Нисунок 2. Предполагаемая модель встраивания маннопротеинов, глюканов и хитина в клеточную стенку дрожжей с участием белков 2 и Vi, , с модификациями ПМ плазматическая мембрана. Справа и в центре глюкаггрансферазы 2 и , предположительно, участвуют во встраивании новосинтезированных цепей р1,3глюкана и комплексов СР1белокр1,6глюкан П,3глюкан в уже существующую клеточную стенку. Звездочкой обозначена ,6гликозидная связь, формируемая 2. Ромб обозначает редуцирующий конец новосинтезированного Р1,6глюкана Слева реакция А приводит к формированию комплекса ОР1белокр1,6глюканхитин.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.196, запросов: 145