Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах

Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах

Автор: Михайлович, Владимир Михайлович

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 197 с. ил.

Артикул: 4749217

Автор: Михайлович, Владимир Михайлович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Глава 1 Биологические микрочипы определение понятия, классификация, назначение
1.1. Классификация микрочипов по типу иммобилизованных зондов
1.2. Способы изготовления микрочипов. Методы иммобилизации зондов.
1.3. Способы регистрации флуоресцентных сигналов в элементах микрочипа
1.4. Принцип работы гпбридизационного микрочипа
1.5. Конструирование микрочинов для идентификационных целей
1.5.1. Выбор мишени для гибридизационного анализа и способа подготовки пробы
1.5.2. Конструирование набора дискриминирующих олигонуклеотидов
1.5.3. Влияние положения и типа запрашивающего нуклеотида в составе иммобилизованного зонда на специфичность гибридизационного анализа
1.6. Условия проведения гибридизации и постгибридизационной отмывки
Глава 2 Ферментативные методы анализа на микрочинах
2.1. Реакции фосфорилирования и лигирования на микрочипах
2.2. Реакция удлинения праймера на один нуклеотид
i i xi
2.3. Амплификационные методы на микрочипах.
Полимеразная цепная реакция и аллельспецпфичная ПЦР.
Глава 3 Специальная часть.
Инфекционные агенты, избранные для анализа, и методы их идентификации.
3.1. Возбудитель туберкулеза характеристика и методы изучения
3.2. Идентификация возбудителя сибирской язвы и его дифференциация от близких видов рода ВасШш
3.3. Идентификация ортоиоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину
3.4. Идентификация и количественное определение возбудителей ВИЧинфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови
3.5. Методы выявления мутации, ответственных за устойчивость ВИЧ1 к ингибиторам протеазы
3.6. Идентификация и типирование вируса гриппа А
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Материалы
4.
4.
4.
1. Клинические образцы и нуклеиновые кислоты
1.2. НК из штаммов i i
1.3. НК из штаммов рода i
1.4. НК ортоиоксвирусов фрагментированные
1.5. Препараты ДНК герпесвирусов V и VV
1.6. НК вирусов иммунодефицита человека , гепатитов
4.1.1.7. Клинические образцы донорской плазмы крови
4.1.1.8. НК вирусов гриппа типа А
4.1.1.9. Клинические нолевые образцы вирусов гриппа А
4.1.2. Коммерческие препараты НК
4.1.3. Флуоресцентные красители
4.2. Методы
4.2.1. Выделение ДНК из штаммов i
i для проведения ПЦР получение бактериальных лизатов
4.2.2. Подготовка препаратов ДНК М. i из
клинических образцов
4.2.3. Определение чувствительности штаммов
М. i к рифампицину и изониазиду
4.2.4. Выделение ДНК из вегетативных клеток бацилл
4.2.5. Выделение, фрагментирование и введение
флуоресцентной метки в РНК бацилл
4.2.6. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из
образцов донорской крови
4.2.7. Количественное определение вирусных НК
4.2.8. Выделение РНК из рсференс штаммов вируса
гриппа А
4.2.9. Олигонуклеотидные зонды и праймеры для
амплификации
4.2 Олигонуклеотидные микрочипы ii и
Биочипгм
4.2 Анализ длин продуктов ПЦР
4.2 Секвенирование ДНК
4.2 Гибридизация на микрочипе
4.2 Мультиплексная общий случай
4.2 Регистрация результатов гибридизации и i
4.2 Анализ температур плавления гнбридизационных
комплексов на микрочипе
4.2 Определение предела чувствительности метода
i i
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5 Разработка эффективного способа идептпфнка
ции функционально и таксономически значимых участков бактериальной и вирусной ПК методом
гибридизации на биологическом микрочипе
5.1. Выбор мишени для гибридизационного анализа
5.2. Разработка оптимального способа подготовки пробы
для гибридизации
5.3. Конструирование набора дискриминирующих
олигонуклеотидов
5.3.1. Сравнительный анализ отношений сигналов при
использовании дискриминирующих пар олигонуклеотидов полностью комплементарных мишени
и имеющих одно два некомплементарных основания
5.3.2. Определение положения запрашивающего
нуклеотида в составе иммобилизованного зонда, обеспечивающего лучшую дискриминацию
5.4. Разработка условий гибридизации амплифициро
ванных участков НК на биологических микрочипах
5.4.1. Оптимизация температурного и временного режима
гибридизации
5.4.1.1. Определение оптимального времени гибридизации
5.4.1.2. Влияние условий постгибридизационной отмывки
на дискриминацию совершенных и несовершенных гибридизационных комплексов
5.4.1.3. Влияние исходной концентрации молекулымишени
в образце на результаты гибридизационного анализа
5.4.2. Применение гибридизационного анализа для
дифференциации смесей НК
Глава 6 Разработка ферментативных методов анализа на
биологических микрочипах
6.1. Лигазная детектирующая реакция
6.2. ПЦР на микрочиие i
6.3. Аллельспецпфичная ПЦР
6.4. ПЦР в режиме реального времени на микрочиие
i i
6.4.1. Определение первоначальной концентрации мишени
в образце. Динамический диапазон определения.
Глава 7 Разработка специализированных микрочипов
7.1. Метод идентификации микобактерий туберкулез
ного комплекса с одиовременнымопредслением их лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду на олигонуклеотидных микрочипах
7.2. Идентификация возбудителя сибирской язвы и
дифференциация его от близких видов рода i
7.2.1. Дифференциация i i от близких видов
методом гибридизации рРНК на биологическом микрочипе
7.2.2. Идентификация i i методом мульти
плексной ПЦР на олигонуклеотидных биочипах
7.3. Идентификация ортопоксвирусов и возбудителей,
вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину
7.3.1. Видовая идентификация ортопоксвирусов методом гибридизации на биочипе
7.3.2. Идентификация возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину
7.4. Идентификация и количественное определение возбудителей ВИЧинфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови
7.5. Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ1 к ингибиторам протеазы и результаты их применения
7.6. Разработка биологического микрочипа для типироваиия вируса гриппа Л Заключение
ВЫВОДЫ Приложения
1. Примеры использования олигонуклеотидных микрочипов для анализа геномов микроорганизмов и вирусов.
2. Программное обеспечение для выбора олигонуклеотидных зондов, доступное в сетевых ресурсах.
3. Список последовательностей олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе.
4. Список иммобилизованных зондов для идентификации мутаций устойчивости ВИЧ1 к ингибиторам протеазы
5. Некоторые полезные сел евые ресурсы Список литературы
список ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВЬАЗТалгорптм i i
ВИЧ1 IV1 вирус иммунодефицита человека 1го типа Iii Vi
вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография i ii
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота xii i
кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота xii i
МВТ микобактерии туберкулеза i i
НК нуклеиновые кислоты i i
п.о. пар оснований i
ПЗС прибор с зарядовой связью vi
ПЦР полимеразная ценная реакция i i
РНК рибонуклеиновая к 1 юлота ii i
рРНК рибосомальная рибонуклеиновая кислота i ii i
тнз точечная нуклеотидная замена ii i
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ii i i
X экстенция праймеров на чипе метод i xi
аллельспецифичная ПЦР ii
коллекция культур i i
Центры по контролю и предотвращению заболеваний Атланта, США i vi ,
пороговый цикл флуоресценции
дидсзоксирибонуклсозид трифосфат ixi i
дезоксирибонуклеотид трифосфаты xi i
I иммуноферментный vi
сорбционный анализ i
I метод гибридизации i i i i iii
геномэквивалент в мл iv iii
гуанидина изотиоционат iii ii
гемагглютинин ii
V вирус гепатита В ii Vi
V вирус генати га С ii Vi
V вирус простого герпеса ix Vi
I микрочипы для идентификации Iiii i
I изониазид iii
I Iэлсмент ii
междуародиЫС СДИ ицы Ii i
определения IiII нагрузки в мл iii
тысяч оснований i
лигазпая детектирующая реакция i i i
несовершенный гибридизацпонный дуплекс i x
штаммы с множественной лекарственной устойчивостью i i i
нейрамннидаза ii
ЫацетилЬцистеин i
амплификационные подходы i i iii
коллекция культур i i
i ПЦР на микрочние
фосфатносолевой буфер i
совершенный гибридизационный дуплекс x
амплификация по типу катящегося кольца метод ii iii
i количественная в
i режиме реального времени
на микрочипе
полиморфизм длин рестрик ii
ционных фрагментов i
I рифамгшцин iii
метод резонансного светового рассеяния i i
Регион, определяющий iii i
устойчивость к рифампицину ii i
ПЦР со стадией обратной транскрипции v ii
серийный анализ генной i i
экспрессии метод xi
амплификация с i
вытеснением цепи метод iii
натрия додецилсульфат i
реакция удлинения праймера на один нуклеотид i i xi
на гри йцитратиый буфер i i
метод конформационного i i
полиморфизма одноцепочечных фрагментов i
ТЕ ТрисЭДТА буфер i
температура плавления i
тетраметиламмония хлорид i i
фактор некроза опухолей i
VV вирус ВарицеллаЗостер Vi vi
X штаммы МВТ, устойчивые к xiv i
препаратам первого и второго рядов и к одному из аминогликозидных антибиотиков i
ВВЕДЕНИЕ


Например, гибридизационный микрочип для идентификации устойчивых форм возбудителя туберкулеза, описанный в данной работе, позволяет получить результат в течение одних суток, при этом идентифицируя более ти минорных изменений в последовательностях пяти генов i i. Гибридизационный же анализ, выполняемый на микрочипах, как показал наш опыт, основанный на применении метода более чем в ти учреждениях противотуберкулезной службы, является более доступным для использования в практической лабораторной диагностике. Еще одно преимущество микрочипов, связанное с иммобилизацией специфичных праймеров в отдельные ячейки, т. ПЦР. Стоит отметить, что именно из лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН вышли пионерские работы как по гибридизационному анализу на олигонуклеотидных микрочипах iv, , так и по разработке ПЦР на биочипе iv . Таким образом, актуальность выбранной проблемы представляется достаточно очевидной потенциальные возможности олигонуклеотидных микрочипов далеко не раскрыты, что серьезно ограничивает области и масштабы их применения. Подходы, используемые при разработке перечисленных выше методов, возникающие проблемы и пути их решения, а также описание полученных результатов представлены в настоящей работе. Целью работы является разработка ферментативных и гибридизационных методов идентификации вирусных и бактериальных агентов, определения генетических детерминант резистентности и токсинообразования на биологических микрочипах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Диссертация изложена на 7 страницах, содержит рисунков, таблиц и 5 приложений. Глава 1. Последние достижения в области молекулярной биологии и биотехнологии, сопровождающиеся развитием методов компьютерного анализа привели к существенному прорыву в геномных исследованиях. Имеющиеся в наличии более 0 проссквенированных геномов . Среди инструментов новой постгеномной эры дифференциальные дисплеи i и , , секвенирование библиотек кДНК . ДНК см. Одной из важных исследовательских ниш, которая практически монопольно занята микрочипами, является изучение генной экспрессии. Наряду с этим, в последнее десятилетие развивается и принципиально иное направление разработка биочипов для диагностических целей , . Принятое в литературе понятие диагностические микрочипы не в полной мерс отражает их функциональное назначение и в действительности является более емким. По этой причине в обзоре будет использовано иное название микрочипы для идентификации I Iiii i. Данные микрочипьт могут применяться для идентификации нуклеиновых кислот НК при определении а таксономических единиц штамм, вид, род и более крупные таксоны и генотипирования штаммов б генов, специфичных для конкретных микроорганизмов и вирусов например, гены уреазы у i i и i в генов токсинообразованпя протективный антиген и летальный фактор i i г генов или полиморфизма, ассоциированных с лекарственной устойчивостью лактамазы Ыа, малой субъединицы РНКполпмеразы гроВ д типов диагностически важных белков например, белковых составляющих гликопротеинов гемагпиотииина и нейраминидазы у вируса гриппа шдр. Как уже упоминалось, с помощью 1МА может быть также успешно решена часть задач, направленных на выяснение структуры и функций геномов. Идентификация вышеперечисленных мишеней на биочипах основана на их способности гибридизоваться с дифференцирующими олигонуклеотидами зондами, иммобилизованными на подложке микрочипа. В отдельное направление можно выделить разработку биологических микрочипов, использующих не гибридизациониый подход, а ферментативные реакции, полностью или частично выполняемые в камерах микрочипов. К наиболее известным из этих реакций относятся полимеразная цепная реакция и ее варианты iv . Сет . ДНКмикрочипы могут быть разделены на две основные группы олигонуклеотидные микрочипы и чипы, содержащие в качестве зондов амплифицированную кДНК , . Обычная длина иммобилизованных олигонуклеотидов составляет от до оснований, а более длинные зонды, применяемые для изучения экспрессии генов, получают методом ПЦР с кДНК. Несмотря на то, что оба формата относительно хорошо зарекомендовали себя при использовании в гибридизационном анализе, следует рассмотреть присущие им достоинства и недостатки.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.192, запросов: 145