Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК

Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК

Автор: Фалалеева, Марина Витальевна

Шифр специальности: 03.00.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 153 с. ил.

Артикул: 4421588

Автор: Фалалеева, Марина Витальевна

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Методы прямого выявления РНК
1.1.1 Блотгибридизация РНК
1.1.2 Анализ РНК, основанный на с защите с помощью комплементарной РНК от действия РНКаз i i
1.1.3 Выявление РНК с помощью гибридизации i i.
1.1.4 Выявление РНК с помощью ренликазы.
1.2 Методы обнаружения РНК, основанные на определении е кДНК.
1.2.1 Общая характеристика обратных транскриптаз ретровирусов
1.2.2 ДНКмикрочипы
1.3 Полимеразная цепная реакция
1.3.1 Проведение ОТГ1ЦР в смеси, содержащей одну ДНКиолимеразу.
1.3.2 Рекомбинация, происходящая в ходе ПЦР
1.3.3 Неспецифический синтез ДИК при ПЦР.
1.3.4 Способы обнаружения продуктов ПЦР
1.3.5 Виды количественной ПЦР
1.4 Заключение.
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 Методы генетической инженерии.
2.1.1 Штаммы i
2.1.2 Микробиологические среды.
2.1.3 Трансформация клеток . i.
2.1.4 Выделение и очистка плазмидной ДИК
2.1.5 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.1.6 Реакции, используемые для получения тупых концов ДИК.
2.1.7 Фосфорилирование нуклеиновых кислот
2.1.8 Дефосфорил ирование ДНК
2.1.9 Дсфосфорилирование РНК.
2.1. Лигазная реакция.
2.1. Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот.
2.1. Фенольная депротеинизация нуклеиновых кислот.
2.1. Обессоливание нуклеиновых кислот с помощью пропускания через
x
2.1. Транскрипция.
2.1. Обработка РНК ДНКазой
2.1. Элюция нуклеиновых кислот из полиакриламидного геля
2.1. Элюция ДНК из агарозного геля.
2.2 Выделение нуклеиновых кислот из биологических образцов
2.2.1 Кровь.
2.2.2 Выделение РНК по методу Хомчинского и др. i i
2.2.3 Модифицикация метода Хомчинского и др. для выделения РНК из цельной
2.2.4 Выделение нуклеиновых кислот на фильтрах фирмы
2.2.5 Выделение суммарных нуклеиновых кислот из крови новым методом.
2.2.6 Оценка выхода РНК с помощью радиоактивности.
2.2.7 Получение препарата нуклеиновых кислот из . i.
2.3 Химические модификации РНК
2.3.1 Получение окисленной РНК
2.3.2 Биотинилирование Зконца окисленной РНК
2.3.3 Обработка РНК анилином
2.3.4 Химический гидролиз РНК.
2.4 Деградация РНК под действием полинуклеотидфосфорилаз
2.4.1 Деградация РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы
i.
2.4.2 Гельшифт анализ связывания РНК с ПНФазой.
2.4.3 Деградация РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы ii i. .
2.5 Реакция рекомбинации РНК под действием репликазы и выявление рекомбинантов .
2.6 Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция.
2.6.1 Расчт концентрации мишеней и разведение
2.6.2 Режим полимеразной цепной реакции.
2.6.3 Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в одной смеси.
2.6.4 Полимеразная цепная реакция в жидкости с использованием ДНК
полимеразы.
2.6.5 Синтез кДНК при помощи обратных транскриптаз ретровирусов.
2.7 Методы анализа белков и нуклеиновых кислот
2.7.1 Электрофорез нуклеиновых кислот в 1 агарозном геле.
2.7.2 Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле в
неденатурирующих условиях
2.7.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле в
денатурирующих условиях
2.7.4 Электрофорез нуклеиновых кислот высокого разрешения
2.7.5 Окрашивание гелей бромистым этидием.
2.7.6 Окрашивание полиакриламидных гелей серебром.
2.7.7 Выявление радиоактивномеченной РНК в полиакриламидном геле.
2.7.8 Измерение концентрации нуклеиновых кислот на спектрофотометре.
2.7.9 Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия
2.8 Метод молекулярных колоний.
2.8.1 Приготовление тонкого слоя полиакриламидного геля.
2.8.2 Обратная транскрипция в полиакриламидном геле с использованием
ретровирусных обратных транскриптаз
2.8.3 ПЦР в полиакриламидном геле.
2.8.4 Обнаружение и идентификация колоний нуклеиновых кислот
2.9 Описание ДИК и РНК мишеней.
2.9.1 РНК бактериофага
2.9.2 РНК вируса СПИДа
2.9.3 ДНК вируса гепатита В.
2.9.4 Фрагмент мРНК АМЫЕТО.
2.9.5 5фрагмент и Зфрагмент КО 5. РНК
2.9.6 Получение олигонуклеотида К с точным 5концом.
2.9.7 РНКрекомбинанты
2.9.8 5 и Зфрагмент ШТЕРвЕР РНК и вРР РНК.
2. Определение структуры рекомбинантных РНК, образованных репликазой фага ОР и размноженных с помощью ОТ1II Р.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1 Цель и экспериментальные задачи
3.2 Ложноотрицательные результаты и их устранение
3.2.1 Разработка метода одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови. .
3.2.2 Усовершенствование метода выделения РНК.
3.2.3 Резюме
3.2.4 Выбор обратной транскриптазы
3.2.5 Снижение неспецифического синтеза кДНК при уменьшении количества
обратной транскриптазы.
3.2.6 Резюме.
3.3 Ложноположительные результаты и способы их устранения.
3.3.1 Возникновение рекомбинантной кДНК на стадии обратной транскрипции
3.3.2 Зависимость частоты ложной рекомбинации РНК от наличия активности
РНКазыН.
3.3.3 Влияние концентрации обратной транскриптазы на частоту ложной
рекомбинации РНК
3.3.4 Снижение частоты ложной рекомбинации РНК при проведении обратной
транскрипции в геле.
3.3.5 Резюме.
3.4 Избирательно уничтожение РНК с помощью полинуклеотидфосфорилазы
3.4.1 Применение ПНФазы ii i для деградации РНК.
3.4.2 Свойства иолинуклеотидфосфорилазы i
3.4.3 Снижение частоты ложной рекомбинации РНК путем уничтожения одного из
субстратов ПНФазой.
3.4.4 Защита РНК модификацией 3конца.
3.4.5 Защита РНК от действия ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным
внутреннему участку РНК
3.4.6 Резюме.
3.5 рименение разработанных подходов для изучения истинной рекомбинации РНК, осуществляемой репликазой.
3.5.1 Резюме.
3.6 римсненис разработанных подходов для высокочувствительной и специфичной диагностики.
3.6.1 Определение вирусных РНК и ДНК в крови
3.6.2 Обнаружение маркера острого миелоидного лейкоза мРНК 1 ЕТО в
образцах пациентов.
3.6.3 Резюме.
3.7 Заключение.
3.7.1 Способы увеличения специфичности ОТПЦР.
3.7.2 Использование ПНФазы для получения РНК заданной длины.
3.7.3 Использование ПНФазы для изучения рекомбинации РНК
ВЫВОДЫ.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Использованные сокращения
А аденин или остаток адениловой кислоты
1 химерная последовательность, состоящая из частей генов
1 продукт гена 1, который является транскрипционным фактором, участвующим в дифференцировке кроветворных клеток
ЕТО продукт гена ЕТО транскрипционный фактор ренрессор транскрипции,
взаимодействует с гистондеацстилазным комплексом
V vi i Vi вирус птичьего миелобластоза
С цитозин или остаток цитидиловой кислоты
2дезоксирибонуклеозид5трифосфаты , , С, Т
ДТТ дитиотрейтол
ЭДТА этилендиаминЫ,Ы,ЬГ,Ктетрауксусная кислота гуанин или остаток гуаниловой кислоты зеленый флуоресцирующий белок V вирус гепатита В
Ы2оксиэтилнинеразинЫ2лтансульфоновая кислота IV Iii Vi вирус иммунодефицита человека
линейный полиакриламид
V i i Vi вирус крысиной лейкемии Молони репликаза РНКзависимая РНКнолимераза бактериофага рибонуклеозид5трифосфаты , , С,
ДСН додецилсульфат натрия Т тимин или остаток тимидиловой кислоты
ДНКполимераза ДНКзависимая ДНКполимераза из i НННтетраметилэтилендиамин
ДНКполимераза ДНКзависимая ДНКполимераза из i
ПНФаза полинуклеотидфосфорилаза из i
урацил или остаток уридиловой кислоты
Бисакриламид .метиленбисакриламид
Бицип ,ii
БСА бычий сывороточный атьбумин
Да дальтон единица молекулярной массы, равная массе атома водорода ДНК 2дсзоксирибонуклеиновая кислота кДНК копия РНК в виде ДНК
Ки кюри, единица радиоактивности, равная 2, х Ю распадов за 1 мин ММК метод молекулярных колоний мРНК матричная РНК
нт нуклеотид единица длины одноцепочечной нуклеиновой кислоты оптические единицы ОТ обратная транскрипция
ОТПЦР полимеразная ценная реакция, предваряемая обратной транскрипцией п.о. пар оснований единица длины двуцепочечной нуклеиновой кислоты
ПААГ полиакриламидный гель полиЛ полиадсниловая кислота ПСА персульфат аммония ПЦР полимеразная цепная реакция ПЭГ полиэтиленгликоль РНК рибонуклеиновая кислота Трис трисоксимстиламинометан
ВВЕДЕНИЕ


Высшие эукариоты содержат ООО генов i , из которых около , как считается, экспрессируются в какойлибо отдельной клетке, чтобы обеспечить такие разнообразные жизненные процессы, как развитие и дифференцировку, гомеостаз, ответ на повреждение, регуляцию клеточного цикла, старение, запрограммированную клеточную смерть и рак. Для изучения изменения клеточных процессов следят за появлением или изменением количества определенных РНК. Поскольку большая часть мРИК представлена в клетке в малом количестве копий . Чувствительность и специфичность особенно важны при выявлении вирусных РНК или РНКонкомаркеров в диагностических целях. Существует большое число подходов выявления и оценки количества РНК, среди них методы прямого выявления РНК, а также методы, полагающиеся на определение ДНКкоиии этой РНК. Для выявления интересующей РНК данным методом препарат суммарной РНК, иммобилизованной на мембранном фильтре, подвергают гибридизации с меченым ДНКили РНКзондом i . Перед анализом РНК обычно денатурируют, инкубируя в растворе, содержащем смесь глиоксаля и диметилсульфоксида i или формамида и формапьдегида . Денатурацию проводят для того, чтобы разрушить вторичную структуру РНК и, тем самым, увеличить число способных к гибридизации фрагментов. Выделяют дотблот гибридизацию и Нозсрнблот гибридизацию. РЫК из геля на мембранный фильтр. Далее мембранные фильтры гибридизуют с меченой РНК или ДНК, комплементарной интересующей последовательности . Дотблот анализ позволяет ответить на вопрос есть ли в данном образце искомая последовательность, а Нозернблот анализ позволяет также регистрировать размер и целостность интересующей РНК. Это делает возможным, например, детектировать продукт,I альтернативного сплайсинга, определять время жизни РНК, а в некоторых случаях появление мРНК аномального размера может свидетельствовать о наличии опухоли i . Используя блотгибридизацшо, можно осуществлять количественную оценку, если в том же анализе использовать разведения известного количества интересующей РНК. Среди недостатков данных методов следует отмстить их трудомкость и длительность. Недостатком Нозернблот анализа также являются высокие требования к качеству РНК даже небольшая деградация РНК, которая может происходить на стадии подготовки образца или в ходе электрофореза, значительно снижает качество получаемой картинки. Однако главным недостатком данных методов является их низкая чувствительность, которая зависит от типа мечения зонда, используемого для гибридизации, но обычно не превышает пикомолярных количеств РНК i . Для увеличения чувствительности до аттомолярных количеств РНК, то есть молекул используют модифицированный Нозернблот анализ , в котором РНК сначала разделяют по размеру, фракцию РЫК искомого размера мстят радиоактивным фосфором с помощью полинуклеотидкиназы, затем гибридизуют с олигодезоксинуклеотидом, несущим биотиновую группу и комплементарным интересующей последовательности, далее смешивают со стрептавидином, после чего разделяют в геле с помощью электрофореза. Гель анализируют с помощью авторалиографии. В данном случае РНК, содержащая искомую последовательность, связывается со стрептавидином и меняет подвижность в геле при электрофорезе. Таким образом, применение методов блотгибридизации РНК ограничивается задачами, в которых не требуется чувствительность детекции, измеряемая единичными молекулами. Этот анализ основан на том, что гибрид изучаемой РНК с РНКзопдом является устойчивым к действию РНКазы А и Т1 . Рис. Рис. Рис. Рис. Г, а затем разделяют с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Гель анализируют с помощью авторадиографии. Рис. Д. РНКзонд обычно получают с помощью i vтранскрипции плазмиды, несущей последовательность, комплементарную изучаемой, под контролем промоторов фаговых РИКполимераз Т7 или 6. В результате транскрипции получают РНК, часть которой комплементарна последовательности интересующей мРНК, а часть векторной плазмиде обычно пт. После отжига между РНК зондом и интересующей РНК образуется частичный дуплекс, поэтому после обработки РНКазой и расплавления РНКзонд становится короче на заданную величину и меняет свою подвижность при электрофорезе.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.187, запросов: 145